1、油茶是我國南方重要的木本油料樹種,也是世界四大木本油料樹種之一。茶油是優(yōu)質(zhì)的食用油,主要由油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸組成,其含量一般在90％以上。在油脂合成過程中,乙酰輔酶A?；D(zhuǎn)移酶(AACT)催化蛋白質(zhì)的?；腿ヵ；?而脂肪酸脫飽和酶6(FAD6)則控制油酸脫氫形成亞油酸和亞麻酸等多不飽和脂肪酸。本研究在油茶種子cDNA文庫和EST序列的基礎(chǔ)上,通過油茶種子RNA提取、簡并RT-PCR、RACE、生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)等方法分

2、離克隆了油茶AACT和FAD6基因的全長cDNA,并研究了其原核表達(dá),為揭示油茶油脂合成規(guī)律和油茶的分子育種提供了理論依據(jù)和科學(xué)基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.油茶AACT基因的全長cDNA克隆。通過序列分析從本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的油茶近成熟種子EST文庫中鑒定出一條油茶AACT基因,克隆編號為6155,總長度為1414bp,編碼序列1159bp,含203bp的完整的3’端UTR(Untranslated region,非轉(zhuǎn)錄區(qū))

3、。通過Blast分析發(fā)現(xiàn)油茶AACT基因5’端缺失約14個氨基酸殘基。在已知油茶AACT基因EST序列基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)6條特異引物,以油茶優(yōu)良無性系‘湘林1號’種仁總RNA為模板,通過反應(yīng)體系和反應(yīng)條件優(yōu)化,最終通過AUAP/GSP2引物組合擴(kuò)增出一條700bp左右的目的片段,將該片段回收、克隆、測序,獲得718bp的cDNA序列,將該序列與油茶AACT基因進(jìn)行序列拼接,確定了油茶AACT基因的全長cDNA序列,將該序列提交至GeneBan

4、k,登錄號為GU594059。
　　 2.油茶AACT基因的生物信息學(xué)分析。油茶AACT基因全長cDNA序列為1495bp,含有一個1227bp的ORF,編碼408個氨基酸殘基；此外還含有長65bp的5’端非編碼區(qū),長203bp的3’端非編碼區(qū)及一個polyA尾巴。在氨基酸序列水平上,該基因與胡黃連(P.kurrooa)的AACT基因的相似性最高,為86％,與稻瘟病菌(M.grisea)的最低,為65％。通過在線預(yù)測,油茶AAC

5、T基因編碼蛋白的等電點(diǎn)pI為6.19,分子量Mw為41628.6Da,不穩(wěn)定系數(shù)為25.73,屬于穩(wěn)定蛋白；該蛋白整體表現(xiàn)為疏水性,存在有極小幾率的信號肽,是一個非分泌蛋白。次蛋白內(nèi)含有40.44％的α-螺旋,15.44％的β折疊,具有6個不為明顯的螺旋結(jié)構(gòu)。模體搜索結(jié)果表明在AACT上具有兩個硫解酶結(jié)構(gòu)域,并存在多種N-糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、硫解酶活性位點(diǎn)等多個功能結(jié)構(gòu)域。
　　 3.油茶AACT基因的原核表達(dá)。將

6、測序?yàn)檎_的重組克隆質(zhì)粒(pMD18-AACT)用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切并回收后,與同樣雙酶切回收的PET28a相連接,轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中,得到的轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR鑒定和雙酶切分析,篩選出符合正確閱讀框的重組子,成功地構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒(pET28a-AACT),并得到了油茶AACT蛋白,分子量為41628.6Da,與預(yù)期分子量大小完全一致。
　　 4.油茶FAD6基因的全長cDNA克隆。根據(jù)GeneBank中已發(fā)布的FAD

7、6基因的序列信息,通過核苷酸序列和氨基酸序列的多序列比對,在FAD6基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)一對簡并引物,以油茶優(yōu)良無性系湘林一號種仁總RNA為模板,通過簡并RT-PCR、回收、克隆、測序后,獲得一條486bp的cDNA序列,Blast分析后確定該序列即為油茶FAD6基因部分序列,與茶樹(Camellia sinensis)的CsFAD6基因相似性最高,為96％,僅有11處堿基不同。根據(jù)茶樹CsFAD6基因的全長cDNA序列信息,在包含起始密碼

8、子和終止密碼子附近設(shè)計(jì)一對特異引物,通過RT-PCR、回收、克隆、測序,成功獲得一條長為1451bp的cDNA序列,序列分析確定該序列即為油茶FAD6基因的全長cDNA,并將該序列提交至GeneBank,登錄號為GU594060。
　　 5.油茶FAD6基因的生物信息學(xué)分析。油茶FAD6基因ORF(OpenReading Frame,開放閱讀框)大小為1347bp,編碼448個氨基酸殘基；在氨基酸序列水平上,該基因與茶樹(C.s

9、inensis)的CsFAD6基因的相似性最高,為86％,與洋藍(lán)薊(E.gentianoides)的最低,僅為36％。通過在線預(yù)測,油茶FAD6基因編碼蛋白的等電點(diǎn)pI為8.67,分子量Mw為51382.3Da,不穩(wěn)定系數(shù)為43.90,屬于不穩(wěn)定蛋白；具有兩個跨膜結(jié)構(gòu)域,沒有信號肽切割位點(diǎn),是一個非分泌蛋白。該蛋白內(nèi)含有45.76％的α-螺旋,7.59％的β-折疊,可能存在4個螺旋結(jié)構(gòu)。模體搜索結(jié)果表明在油茶FAD6上存在一個Cyt-b