1、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應(yīng)用姓名：曲連東申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：獸醫(yī)指導(dǎo)教師：陳溥言20060501豬圓環(huán)病毒2型地方株的分離鑒定和診斷方法的建立及應(yīng)用河南、遼寧、青海、廣東、北京、吉林、江西，山西和天津等12省(市)具有PMWS癥狀的豬現(xiàn)地樣品513份進(jìn)行了PCV2PCR檢測，確定了115份樣品PCV2PCR陽性，陽性率為220％’其中河南陽性率較高，達(dá)750％；青海陽性率為0％；其他省

2、(市)陽性率在6O％480％之間。對來自黑龍江大慶、靠河寨和吉林公主嶺具有PMWS癥狀的3個(gè)豬場現(xiàn)地樣品檢測，確定PCV2PCR的陽性率在51％737％之間，其中2002年3月4月，大慶某豬場的78份樣品中PCV2PCR陽性數(shù)為4份，陽性率為51％：2002年4月6月，靠河寨某豬場的78份樣品中PCV2PCR陽性數(shù)為9份，陽性率為115％；2003年一2005年，公主嶺某豬場的38份樣品中PCV2PCR陽性數(shù)為28份，陽性率為737％。

3、結(jié)果表明上述省(市)PCV2感染程度雖然不同，但不同地區(qū)豬場具有PMWS癥狀豬與PCV2感染有相關(guān)性，且PCV2感染表現(xiàn)為上升趨勢。擴(kuò)增并克隆了PCV2一L的基因組和Cap基因，獲得了重組質(zhì)粒pMDTPCV和pMDTCap。利用ORF2基因內(nèi)部中間部位的EcoRI位點(diǎn)，將ORF2基因分成氨基端和羧基端兩部分，構(gòu)建了重組袁達(dá)質(zhì)粒pGEXPCV737—421和pGEX—PCV42137，并分別進(jìn)行了原核高效誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了重組蛋白PCV73

4、7421和重組蛋白PCV421—37，表達(dá)量分別為192％和134％。重組蛋白PCV737—421和重組蛋白PCV42137制備的小鼠免疫血清均可特異性檢測到PCV2L利用重組蛋白PCV421—37建立了PCV2間接ELISA，與IFA對比試驗(yàn)表明二者符合率達(dá)834％。2005年，對黑龍江、吉林和河南3個(gè)省4個(gè)具有PMWS癥狀的豬場共40份血清樣品進(jìn)行了PCv2問接ELISA檢測，陽性數(shù)為35份，陽性率達(dá)875％。利用重組蛋白PCV73

5、7421和重組蛋白Pcw21—37作為免疫原，通過雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，IFA方法篩選出單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞21株。利用重組蛋白PCV737421作為免疫原，篩選出單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞16株，其中單抗887一B1、9E2A10和986A7僅與PCV2感染PKl5細(xì)胞有IFA反應(yīng)性，而與PCVl感染PKl5細(xì)胞沒有IFA反應(yīng)性，為PCV2特異性；其余13株與PCV2和PCVl均有1FA反應(yīng)性，為PCV特異性；利用重組蛋白PCV42137作為免疫

6、原，篩選出單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞5株，均與PCV2和PCVl有LFA反應(yīng)性，為PCV特異性。亞型鑒定結(jié)果表明，3株單抗3F4D10、984D8和26H5A3為IgGl亞類，其余18株均屬于12M亞類；21株單抗的輕鏈均屬于K鏈利用單抗986A7腹水作為包被抗體，建立了敏感、特異的PCV2雙抗體夾心ELlSA檢測方法。方陣試驗(yàn)確定了各組份的最佳工作濃度：與PCVl、SIV、PRV、PRRSV、PPV特異性試驗(yàn)表明具有PCV2特異性。與PCV