1、研究背景： 粥樣硬化性腎動(dòng)脈狹窄(ARAS)是腎動(dòng)脈狹窄(RAS)最常見(jiàn)的病因。ARAS的進(jìn)展導(dǎo)致腎動(dòng)脈閉塞、腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)明顯下降和腎臟縮小時(shí)，診斷為缺血性腎病。目前認(rèn)為重度腎動(dòng)脈狹窄和缺血性腎病的病理生理變化是狹窄后腎缺血，不斷激活壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)(包括激活腎素-血管緊張素系統(tǒng)、刺激腎上腺素分泌等)導(dǎo)致惡性高血壓發(fā)生和腎小球?yàn)V過(guò)功能喪失，腎動(dòng)脈進(jìn)行性狹窄是導(dǎo)致缺血性腎病的發(fā)生和進(jìn)展至終末期的主要原因。現(xiàn)有研究成果表明：A

2、RAS是全身動(dòng)脈粥樣硬化性疾病在腎動(dòng)脈的表現(xiàn)，而心血管領(lǐng)域的研究早已證實(shí)動(dòng)脈粥樣硬化病變的實(shí)質(zhì)是慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)，動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成、破裂及進(jìn)行性增大與慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)密切相關(guān)；臨床觀察到輕中度ARAS其腎動(dòng)脈狹窄程度與腎損害嚴(yán)重程度并非完全平行；國(guó)外學(xué)者業(yè)已在臨床研究中發(fā)現(xiàn)ARAS患者腎動(dòng)脈狹窄并不是導(dǎo)致腎實(shí)質(zhì)損害的主要原因，推測(cè)ARAS患者的慢性腎損害可能是由血管狹窄以外的其它因素所致。這些研究結(jié)果提示我們：導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化

3、的炎癥反應(yīng)是否同時(shí)作用于腎實(shí)質(zhì)?除腎動(dòng)脈狹窄引起腎臟慢性缺血性損害以外是否有炎癥因素參與其下游腎臟實(shí)質(zhì)的慢性損害? 由此本文設(shè)想：①炎癥反應(yīng)可能是ARAS腎損害進(jìn)展的重要機(jī)制之一；②通過(guò)下游腎臟病理的變化、腎功能損傷程度以及預(yù)測(cè)因子的動(dòng)態(tài)變化，可預(yù)測(cè)上游ARAS的活動(dòng)情況，為臨床提供早期的治療時(shí)機(jī)；③解除和延緩腎動(dòng)脈狹窄同時(shí)控制可能存在的炎癥反應(yīng)也許會(huì)成為更有效的治療策略。 為驗(yàn)證這些設(shè)想，選擇ApoE-/-小鼠--目前

4、世界公認(rèn)的研究動(dòng)脈粥樣硬化(AS)的成熟動(dòng)物模型來(lái)建立ARAS模型，動(dòng)態(tài)觀察ApoE-/-小鼠在ARAS發(fā)病過(guò)程中腎臟損害的特點(diǎn)；對(duì)ApoE-/-小鼠ARAS腎臟炎癥損害機(jī)制進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；探討Rapamycin對(duì)ApoE-/-小鼠ARAS腎損害進(jìn)展的干預(yù)作用；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，驗(yàn)證炎癥機(jī)制在ARAS患者腎損害中的重要作用，并對(duì)腎動(dòng)脈支架置入術(shù)時(shí)機(jī)進(jìn)行初步的探討。 主要實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果： 一、ARAS小鼠模型的建立及A

5、RAS腎損害特點(diǎn)觀察 選取同周齡C57BL/6JApoE基因敲除小鼠及C57BL/6J野生型小鼠，取材25周齡至51周齡小鼠的腎動(dòng)脈和腎臟，腎動(dòng)脈連續(xù)切片、V.G染色，通過(guò)ImagePro-Plus圖像分析系統(tǒng)(MediaChemeticsInc.USA)測(cè)量、計(jì)算腎動(dòng)脈的狹窄程度。根據(jù)ARAS程度分3組(A組：＜50％；B組：50％-75％；C組：＞75％)。A組又根據(jù)斑塊是否破裂分為A1(未破裂)和A2(破裂)組。腎臟常規(guī)H

6、E、PAS和Masson染色，采用電鏡及普通光鏡動(dòng)態(tài)觀察各組ApoE-/-小鼠腎動(dòng)脈病變及相應(yīng)的腎臟病變。結(jié)果：1、利用ApoE-/-小鼠成功建立了粥樣硬化性腎動(dòng)脈狹窄動(dòng)物模型；2、腎動(dòng)脈和腎臟的變化是：①A1組未發(fā)現(xiàn)其下游腎臟病理改變；②A2組其下游腎內(nèi)腎小管周圍毛細(xì)血管減少，腎小管上皮細(xì)胞腫脹，電鏡下可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)線粒體腫脹；③B組和C組己發(fā)生斑塊破裂，其腎內(nèi)腎小管周圍毛細(xì)血管減少明顯，與A2組比較，差異顯著(p＜0.01，p＜0.00

7、1)；腎小管上皮細(xì)胞腫脹、脫落、壞死；腎小管間質(zhì)病變嚴(yán)重；④微血栓形成；⑤斑塊破裂后，腎動(dòng)脈狹窄程度與腎小管周圍毛細(xì)血管(PTC)密度、腎小管間質(zhì)損傷(TI)程度明顯負(fù)相關(guān)，PTC密度與TI程度明顯負(fù)相關(guān)。 結(jié)論：選擇ApoE-/-小鼠成功建立ARAS模型；ARAS是進(jìn)展性疾??；腎損害的出現(xiàn)不僅僅是狹窄造成的缺血性損害，缺血以外的損傷機(jī)制參與其中，極有可能是動(dòng)脈粥樣硬化病變的慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)。為此在實(shí)驗(yàn)第二部分對(duì)腎損害的炎癥機(jī)

8、制進(jìn)行探討。 二、ApoE-/-小鼠腎動(dòng)脈粥樣硬化病變進(jìn)展導(dǎo)致下游腎損害的炎癥機(jī)制 1、腎動(dòng)脈粥樣硬化病變活動(dòng)造成腎損害的炎癥因素的測(cè)定：選擇各組ApoE-/-小鼠為實(shí)驗(yàn)組，同期喂養(yǎng)的野生型C57BL/6J小鼠作為對(duì)照組。取各組腎動(dòng)脈及腎臟：采用Westemblotting及免疫組化法檢測(cè)NF-κBp65、ICAM-1及P-sel表達(dá)；ELISA檢測(cè)IL-6和TF的表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)IL-6mRNA測(cè)定；免疫組化法檢

9、測(cè)巨噬細(xì)胞表達(dá)；采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)促炎癥反應(yīng)優(yōu)勢(shì)的單核巨噬細(xì)胞在各組小鼠腎組織中分布變化。 2、ApoE-/-小鼠ARAS腎損傷與炎癥因素的關(guān)系：分別取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組的腎組織，免疫組化方法檢測(cè)α-SMA：偏振光顯微鏡觀察ColⅠ、ColⅢ在腎組織中表達(dá)情況；酶-底物直接顯色法檢測(cè)尿NAG；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血肌酐。研究炎癥因素與腎臟纖維化及腎功能損害的相關(guān)性。 結(jié)果：1、NF-κBp65在ARAS50％-75％

10、的B組表達(dá)顯著高于ARAS小于50％斑塊已破裂的A2組，A2組明顯高于ARAS小于50％斑塊未破裂的A1組，而A1組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其受控因子ICAM-1、P-sel、IL-6的表達(dá)變化與NF-κBp65的表達(dá)變化相似即B組表達(dá)顯著高于A2組，A2組明顯高于A1組，而A1組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；巨噬細(xì)胞及α-SMA的表達(dá)變化也與NF-κBp65的表達(dá)變化相似；尿NAG測(cè)定量變化也與NF-κBp65的表達(dá)變化相似

11、。2、巨噬細(xì)胞在：A2亞組和B組的促炎優(yōu)勢(shì)單核巨噬細(xì)胞在腎小管間質(zhì)及腎小球均有分布，但主要分布于腎小管、腎間質(zhì)和腎血管，以腎間質(zhì)最為明顯；其分布數(shù)量于B組較A2組呈明顯增多，且與腎功能減退呈正相關(guān)。B組腎小管間質(zhì)區(qū)α-SMA及Ⅰ型膠元(ColⅠ)、ColⅢ蛋白質(zhì)表達(dá)均明顯增加，并與TIF程度以及促炎優(yōu)勢(shì)單核巨噬細(xì)胞分布數(shù)量呈正相關(guān)。對(duì)照組和A1亞組促炎優(yōu)勢(shì)單核巨噬細(xì)胞分布及數(shù)量明顯少于A2組和B組，α-SMA、Ⅰ型膠元(ColⅠ)、Co

12、lⅢ蛋白質(zhì)表達(dá)明顯少于A2組和B組，無(wú)腎小管間質(zhì)損害表現(xiàn)，腎功能正常。 結(jié)論：炎癥反應(yīng)是ARAS進(jìn)行性狹窄及其下游腎損害進(jìn)展的重要機(jī)制之一。炎癥反應(yīng)在導(dǎo)致ARAS的同時(shí)，也同樣損傷腎實(shí)質(zhì)，因此炎癥反應(yīng)伴隨在ARAS及其腎損害的始終，炎癥機(jī)制是始動(dòng)因素，缺血機(jī)制在后，共同控制著下游的腎損害。當(dāng)ARAS到一定程度，缺血因素發(fā)生，同時(shí)又會(huì)促進(jìn)下游炎性腎損害加劇，如此惡性循環(huán)導(dǎo)致ARAS腎損害加劇。為了進(jìn)一步證實(shí)這一重要的炎癥機(jī)制，我們

13、在實(shí)驗(yàn)第三部分通過(guò)藥物控制這種炎癥反應(yīng)，觀察是否可以延緩ARAS腎損害的進(jìn)程? 三、免疫抑制劑雷帕霉素對(duì)ApoE-/-小鼠ARAS腎損害進(jìn)展的干預(yù)作用。 由于雷帕霉素可以抑制淋巴細(xì)胞的活化而控制炎癥反應(yīng)，同時(shí)雷帕霉素涂層支架在治療動(dòng)脈粥樣硬化性狹窄后可以控制炎癥反應(yīng)，近期初步的臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)雷帕霉素可以延緩慢性增殖性腎病，所以我們選擇雷帕霉素作為本試驗(yàn)炎癥反應(yīng)控制藥物。 1、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：選擇①33周齡組ApoE-/-

14、小鼠；②藥物組：33周齡ApoE-/-小鼠，予雷帕霉素100μg/kg(Bw)/day灌胃8周至41周齡；③41周齡組ApoE-/-小鼠；④對(duì)照組：41周齡野生型C57BL/6J小鼠。每組6只，均為雄性。檢測(cè)各組腎動(dòng)脈的狹窄程度、腎動(dòng)脈和腎臟M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況、NF-κBp65及IL-6mRNA的表達(dá)情況及腎臟纖維化程度。 2、體外培養(yǎng)：采用雷帕霉素及LPS共同刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，檢測(cè)各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的NF-κBp65

15、和MHCⅡ的表達(dá)情況及IL-6mRNA的轉(zhuǎn)錄水平變化。研究雷帕霉素對(duì)單核巨噬細(xì)胞促炎癥優(yōu)勢(shì)的影響。 結(jié)果：1、雷帕霉素能顯著下調(diào)ApoE-/-小鼠腎臟α-SMA和Ⅰ型、Ⅲ型膠原纖維的表達(dá)；顯著減少腎動(dòng)脈斑塊處及腎臟間質(zhì)M1型巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量；下調(diào)腎動(dòng)脈及腎臟組織NF-κBp65的表達(dá)；減少NF-κBp65下游IL-6的表達(dá)。2、小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激1h后，其核內(nèi)的熒光強(qiáng)度(代表的NF-κBp65表達(dá)量)顯著增強(qiáng).與LPS刺激

16、組相比，不同濃度的雷帕霉素+LPS組均能使NF-κBp65的熒光強(qiáng)度值降低，有顯著性差異，雷帕霉素使NF-κBp65的熒光強(qiáng)度值降低呈劑量依賴性。 結(jié)論：雷帕霉素可以控制ARAS所致的腎臟炎癥反應(yīng)，延緩腎臟纖維化，再次證實(shí)ApoE-/-小鼠ARAS腎損害的重要發(fā)生機(jī)制之一是炎癥反應(yīng)。 四：臨床實(shí)驗(yàn)：在臨床ARAS患者中初步驗(yàn)證動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論。觀察尿NAG/Ucr、尿液巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率、腎活檢應(yīng)用于ARAS篩查及監(jiān)測(cè)治療效果的

17、可能性。檢測(cè)17例ARAS患者、20例合并≥2項(xiàng)動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素的動(dòng)脈粥樣硬化疾病患者及20例同年齡健康者的尿NAG/Ucr、尿液巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率、ARAS組行3例腎活檢等檢測(cè)腎小管間質(zhì)炎癥反應(yīng)指標(biāo)，觀察支架置入術(shù)前后及未行支架術(shù)患者的尿NAG/Ucr、尿液巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率的變化。 結(jié)果：1、尿NAG/UCr、尿液巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率能反映ARAS腎小管間質(zhì)的受損情況，對(duì)監(jiān)測(cè)ARAS進(jìn)展及觀察支架術(shù)治療的效果有一定幫助，但與ARAS狹

18、窄程度不一定完全平行；2、3例腎活檢提示ARAS患者腎損害的重要發(fā)生機(jī)制仍然是炎癥反應(yīng)，其首先累及腎小管間質(zhì)。由于收集樣本時(shí)間有限造成樣本量過(guò)小，需加進(jìn)一步大樣本量研究。 結(jié)論：尿NAG/UCr、尿液巨噬細(xì)胞陽(yáng)性率及腎臟病理可以作為預(yù)測(cè)ARAS活動(dòng)的指標(biāo)，提示控制炎癥治療和放置血管支架的時(shí)機(jī)。 全文結(jié)論：炎癥反應(yīng)是ARAS病變及其下游非缺血腎損害的重要機(jī)制之一。早期控制炎癥反應(yīng)不但可以延緩或阻斷ARAS的進(jìn)展，同時(shí)也是保