1、視覺系統(tǒng)一些疾病會造成視神經(jīng)損傷而引起患者失明，目前臨床上尚無良好的治療方法，而視神經(jīng)再生的研究將為治療這些疾病提供實驗依據(jù)。本研究通過體外培養(yǎng)妊娠晚期大鼠羊膜上皮細胞，予以免疫細胞化學、RT-PCR等方法鑒定后，應用不含血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基誘導大鼠羊膜上皮細胞向類神經(jīng)干細胞方向分化，并予以免疫細胞化學、RT-PCR等方法鑒定。然后，將Hoechst33342熒光標記的正常羊膜上皮細胞與誘導后的羊膜上皮細胞分別移植入大鼠受損視神經(jīng)中，

2、應用Hoechst33342熒光追蹤移植細胞、視網(wǎng)膜HE染色和尼氏染色計數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細胞數(shù)量、視神經(jīng)HE染色、免疫組織化學染色等方法初步探討細胞移植后對視網(wǎng)膜節(jié)細胞的存活和視神經(jīng)軸突再生所產(chǎn)生的作用。結果表明，應用不含血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基可誘導大鼠羊膜上皮細胞向類神經(jīng)干細胞方向分化；誘導前后的羊膜上皮細胞移植入受損視神經(jīng)后，能在損傷部位大量存活并向損傷區(qū)兩端遷移，能提高視網(wǎng)膜節(jié)細胞存活率，增加遠側段視神經(jīng)的細胞數(shù)量，促進視神經(jīng)軸突再生。

3、相對來說，誘導后的羊膜上皮細胞較誘導前的細胞移植對視神經(jīng)修復作用更強些。從而提示我們誘導后的羊膜上皮細胞經(jīng)移植后能促進視神經(jīng)損傷的修復，為臨床修復視神經(jīng)提供新思路。
　　 目的：目前視覺系統(tǒng)一些疾病如青光眼、視神經(jīng)炎、視神經(jīng)退行性變和外傷等均能造成視神經(jīng)損傷而引起失明，但目前尚無良好治療方法，而視神經(jīng)再生的研究將為治療這些損傷提供新思路。視神經(jīng)損傷后形成的抑制性微環(huán)境是制約視神經(jīng)成功再生的主要原因。近年來，人們己從周圍神經(jīng)移植、

4、細胞移植和分子調(diào)控三個層面對視神經(jīng)再生微環(huán)境進行調(diào)控。本研究從細胞移植的角度，體外培養(yǎng)大鼠羊膜上皮細胞并向類神經(jīng)干細胞方向誘導后，再移植入大鼠視神經(jīng)損傷模型中，探討誘導后羊膜上皮細胞對視神經(jīng)修復的作用。
　　 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜組織，序貫消化后進行羊膜上皮細胞原代培養(yǎng)。(2)應用不含血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基誘導大鼠羊膜上皮細胞向類神經(jīng)干細胞方向分化。(3)對正常及誘導后細胞進行免疫熒光細胞化學和RT-PCR鑒定。

5、(4)應用Hoechst33342標記誘導前后的羊膜上皮細胞，制作細胞懸液。(5)將誘導前后的羊膜上皮細胞移植入成年雄性SD大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型中，設以下4組：正常對照組；損傷組，于眼球后2mm處將微電極玻璃管刺入視神經(jīng)，完全吸除一段長約0.5mm的神經(jīng)，致視神經(jīng)完全斷開，但保持視神經(jīng)外膜和血管完整，于視神經(jīng)缺損處注入5μl無血清培養(yǎng)基；未誘導細胞組，在損傷組的基礎上，于視神經(jīng)缺損處注入5μl未誘導羊膜上皮細胞懸液(5×106個/ml)

6、；誘導細胞組，在損傷組的基礎上，于視神經(jīng)缺損處注入5μl誘導的羊膜上皮細胞懸液(5×106個/ml)。(6)術后14d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜，HE染色觀察計數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細胞的數(shù)量。(7)術后28d經(jīng)心灌注固定，取眼球視網(wǎng)膜鋪片，尼氏染色計數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細胞。(8)術后28d經(jīng)心灌注固定，制作視神經(jīng)冰凍切片，觀察Hoechst33342標記細胞的存活分布情況。(9)術后14d、28d視神經(jīng)遠側段HE染色觀察組織結構和細胞密度變化。(10)術

7、后14d，免疫組織化學染色SABC法顯示各組NF陽性物質(zhì)在近側段及遠側段表達情況。(11)術后28 d，免疫組織化學染色SABC法顯示各組GAP-43陽性物質(zhì)在近側段表達情況。
　　 結果：(1)體外成功培養(yǎng)獲得大鼠羊膜上皮細胞，經(jīng)免疫熒光細胞化學染色鑒定羊膜上皮細胞能表達上皮特異性標志物CK-19、神經(jīng)類細胞標志物Nestin、GFAP以及細胞多能性標志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鑒定后顯示，羊膜上皮細胞

8、能表達外胚層神經(jīng)類細胞標志物Nestin、GFAP、Tau，中胚層平滑肌細胞標志物SM-22a以及多能性標志物SOX-2、Nanog。(2)應用不含血清的神經(jīng)干細胞培養(yǎng)基對大鼠羊膜上皮細胞向類神經(jīng)干細胞方向誘導，免疫熒光細胞化學鑒定顯示誘導后的細胞表達上皮特異性標志物CK-19、神經(jīng)類細胞標志物Nestin、GFAP以及細胞多能性標志分子SSEA-4、Vimentin等；RT-PCR鑒定后顯示誘導后的羊膜上皮細胞對外胚層神經(jīng)類細胞標志物

9、Nestin、GFAP、Tau表達較誘導前的表達增強，而中胚層平滑肌細胞標志物SM-22a以及多能性標志物SOX-2、Nanog表達較誘導前減弱。另外，形態(tài)學顯示誘導后的細胞突起較誘導前變長，且可融合成網(wǎng)狀。(3)術后14 d HE染色計數(shù)視網(wǎng)膜節(jié)細胞的數(shù)量，結果顯示損傷組的節(jié)細胞密度較其他各組明顯降低，細胞移植組的節(jié)細胞密度較損傷組明顯增加但仍低于正常組，誘導細胞組的節(jié)細胞密度高于未誘導細胞組。(4)損傷后28 d，尼氏染色視網(wǎng)膜節(jié)細

10、胞的計數(shù)結果顯示損傷組的節(jié)細胞密度較其他各組明顯降低，細胞移植組的節(jié)細胞密度較損傷組明顯增加但仍低于正常組，誘導細胞組的節(jié)細胞密度高于未誘導細胞組。(5)將Hoechst33342核標記細胞移植入大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型后，傷后28 d取視神經(jīng)冰凍切片，可觀察到損傷區(qū)有大量標記的存活細胞，標記細胞能向受損視神經(jīng)近側段和遠側段遷移。(6)HE染色視神經(jīng)顯示，損傷區(qū)有大量細胞存在，呈不規(guī)則條索狀分布并向兩端延伸。傷后14、28 d計數(shù)遠側段細胞

11、結果顯示，未誘導細胞組和誘導細胞組的細胞數(shù)量較損傷組和正常組明顯增多，誘導細胞組的細胞數(shù)量多于未誘導細胞組。(7)傷后14 d免疫組織化學法染色后顯示損傷組視神經(jīng)遠、近側段NF表達顯著下降，著色較淺，并出現(xiàn)串珠樣結構，未誘導細胞組和誘導細胞組的神經(jīng)遠、近側段的NF陽性物質(zhì)較損傷組增多，而誘導細胞組的神經(jīng)遠、近側段的NF陽性物質(zhì)多于未誘導細胞組，另外近側段的NF陽性物質(zhì)多于遠側段。(8)傷后28 d免疫組織化學法染色后顯示損傷組視神經(jīng)GA