1、研究背景:腸三葉因子(intestinal trefoil factor,ITF)是含有59個氨基酸殘基的單鏈多肽[1],分子量為6.7kD,其核心的38～39個氨基酸殘基中包含6個半胱氨酸,形成3對鏈內(nèi)二硫鍵,產(chǎn)生特征性三葉形結構,并因此而得名[10]。研究表明,ITF是具有潛在藥用價值的小分子多肽,能減輕各種致傷因素導致的粘膜損傷,促進腸上皮細胞增殖、移行,從而啟動受損腸粘膜修復,促進粘膜屏障重建[3]。發(fā)現(xiàn)ITF已十余年,人們對I

2、TF進行了多方面的深入研究,包括組織分布、基因定位、重組表達、理化性質(zhì)、抗體制備、氨基酸序列分析、空間結構確證以及大量的功能學研究等[10]。但對ITF表達調(diào)控機制的研究還不夠深入,特別是在生理狀況下如何維持ITF的高表達還不甚清楚。Seib.T首先擴增了人腸三葉因子(human trefoil factor,hITF)的啟動子區(qū)序列[6],預測期間存在多個AP-1和Sp1調(diào)控元件。隨后又發(fā)現(xiàn)了多個元件如缺氧誘導因子反應元件(hypox

3、ia inducible factorl resposnse element,HRE)、丁酸反應元件(butyrateresponse element,BRE)等,這些元件在外界因素刺激下能調(diào)控hITF的轉(zhuǎn)錄和表達[7]。Iwakiri等報道了在鼠類ITF啟動子區(qū)有杯狀細胞反應元件(goblet cell responseelement,GCRE)及杯狀細胞沉默子抑制子(goblet cell silencer inhibitor,GC

4、SI)[8][9],他們能單獨或與其他正性反應元件協(xié)同,促進ITF轉(zhuǎn)錄,確保ITF的特異性高表達。hITF啟動子中是否也有類似元件還不甚清楚,有學者曾預測在hITF啟動子上游存在同源元件,但未進行驗證,關于這個問題目前尚無定論。
　　 研究目的:通過對hITF啟動子的克隆和轉(zhuǎn)錄活性分析,探索hITF特異性高表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
　　 研究方法:
　　 1.基因組DNA提取
　　 按試劑盒E.Z.N.A.(

5、R)Tissue DNA kit說明書操作,從3×106個LS-174T細胞中提取人基因組DNA,去離子水溶解,經(jīng)0.6％瓊脂糖凝膠電泳后鑒定片段大小、完整性及純度。
　　 2.構建hITF啟動子熒光素酶報告載體
　　 ①引物設計
　　 從EMBL數(shù)據(jù)庫中查找含hITF的基因序列AB038162,以此為模板用primer3網(wǎng)上引物設計平臺(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/)設計引物

6、,Tm值設定為60～68℃,上游引物添加MluⅠ酶切位點及3個保護堿基,下游引物添加XhoⅠ或HindⅢ酶切位點及2～3個保護堿基。
　　 ②PCR擴增hITF啟動子片段
　　 以人基因組DNA為模板,KOD-Plus高保真酶擴增啟動子片段,Ta值設定為60～68℃,30～35個循環(huán)。
　　 ⑧克隆至pGL-3 basic熒光素酶報告載體
　　 PCR產(chǎn)物純化回收后用MluⅠ與XhoⅠ(HindⅢ)雙酶切

7、,同時雙酶切pGL-3basic質(zhì)粒,膠回收后用T4 DNA連接酶以3～2:1比例連接克隆片段和質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)挑取陽性克隆,雙酶切鑒定正確后測序。
　　 3.轉(zhuǎn)染HEK-293細胞或LS-174T細胞檢測熒光素酶報告活性
　　 ①細胞擴增及種植
　　 HEK-293及LS-174T細胞用含10％牛血清DMEM培養(yǎng)基放37℃5％CO2孵箱中培養(yǎng),長至80～90％密度后用含10％牛血清DMEM培養(yǎng)基接種于2

8、4孔板中,密度約70～80％,過夜培養(yǎng)待細胞貼壁牢固后進行轉(zhuǎn)染。
　　 ②轉(zhuǎn)染
　　 轉(zhuǎn)染前換用不含牛血清的DMEM培養(yǎng)基,每孔0.5ml,各質(zhì)粒按照等摩爾比進行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染試劑jetPEI與質(zhì)粒按2μl:1μg比例進行換算,轉(zhuǎn)染后6小時換液,轉(zhuǎn)染后48小時裂解細胞并檢測熒光素酶活性。
　　 ③統(tǒng)計分析
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行單因素方差分析,P＜0.05視為差異顯著。
　　 研究結果:

9、
　　 1.通過PCR擴增hITF基因-2331/+79區(qū)域,并成功構建了pGL-3 hITFpro-2500(-2331/+79)熒光素酶報告質(zhì)粒,該質(zhì)粒在LS-174T及HEK-293細胞中活性較低。
　　 2.對-2331/+79片段活性較低進行分析后,預測在外顯子1中的+53/+79區(qū)域有抑制性元件存在,構建的Vx2.5(-2331/+53)質(zhì)粒活性明顯增加,提示+53/+79區(qū)域具有抑制作用。對+53/+179

10、區(qū)域以6bp為單位進行替換突變,mut1、mut2、mut3、mut4突變體活性均大幅上升,表明整個+53/+79區(qū)域都具有強抑制作用。結合文獻分析此區(qū)域可能是抑制轉(zhuǎn)錄起始位點在2號外顯子中的hITF異構體的轉(zhuǎn)錄,從而維持具有生物活性的野生型ITF的表達。
　　 3.根據(jù)第二部分結果發(fā)現(xiàn)在剔除了+53/+79區(qū)域后,Vx2.5活性上升,隨后構建的-2.0,-1.5,-1.0,-0.5kb都以+53為3'端截止位點,各片段活性較高

11、且接近一致。進一步截短發(fā)現(xiàn)-300bp與-200bp之間差異活性顯著,細化分區(qū)表明-280bp與-260bp片段活性差異明顯。結合alibaba2軟件預測明確了正性元件的初步位置位于-280/-251區(qū)域,針對此區(qū)域的-278/-270及-266/-256兩個Sp1結合位點分別進行替換突變,mutMIX1和mut Sp1②突變載體活性大幅下降,為突變前的20～25％。最終明確在-278/-270及-266/-256的兩個Sp1位點對hI