1、背景與目的:
　　最近的研究表明糖尿病發(fā)病與機(jī)體慢性低度炎癥反應(yīng)和固有免疫系統(tǒng)的激活有關(guān),這一發(fā)現(xiàn)更新了以前認(rèn)為糖尿病僅為代謝紊亂性疾病的概念。糖尿病腎病(Diabeticnephropathy,DN)是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病,DN患者隨著糖尿病發(fā)病率及患病率增加而逐年增多。DN的發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療措施一直是近年來的研究熱點(diǎn)。糖代謝紊亂是DN發(fā)病基礎(chǔ),由此產(chǎn)生的腎血流動(dòng)力學(xué)改變、非酶糖基化反應(yīng)、多元醇通路激活、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、

2、足細(xì)胞損傷、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化、蛋白激酶C激活、脂代謝紊亂及遺傳背景等都與DN有關(guān)。炎癥反應(yīng)與DN的發(fā)展有著密切的關(guān)系,在很多DN臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)趨化因子、粘附分子、前炎癥因子表達(dá)異常。糖尿病的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)一些藥物如霉酚酸酯、甲氨蝶呤、紅霉素等可通過抑制炎癥反應(yīng)來防止糖尿病腎損傷的發(fā)生。DN進(jìn)展緩慢,早期不易覺察,目前多以出現(xiàn)微量白蛋白尿做為早期DN的標(biāo)志。DN一旦進(jìn)入到顯性白蛋白尿期,即臨床糖尿病腎病期,則病情發(fā)展迅速,所

3、以目前強(qiáng)調(diào)只有對早期DN進(jìn)行合理干預(yù)才能有效降低DN患者進(jìn)入終末期腎衰的風(fēng)險(xiǎn)。白芍總苷(Totalglucosidesofpaeony,TGP)是中藥白芍的有效提取物,主要含有芍藥苷、羥基芍藥苷、芍藥花苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等成分,其藥理作用有抗炎、抗氧化與免疫調(diào)節(jié)活性。TGP在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療方面已經(jīng)取得了顯著的療效,在實(shí)驗(yàn)性肝損傷、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腎小球腎炎的研究中亦取得了較好的結(jié)果,且無明顯的毒副作用。本研究通過建立早期

4、DN大鼠模型并觀察經(jīng)TGP干預(yù)的療效,進(jìn)一步探討TGP能否通過干預(yù)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激損傷、足細(xì)胞損傷、腎小管上皮轉(zhuǎn)分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種途徑來治療DN。
　　研究方法：
　　建立鏈脲佐菌素糖尿病大鼠模型,將50只大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、TGP給藥組,TGP分為三個(gè)劑量組(50,100,200mg/kg.d)每日灌胃給藥,對照組和模型組每日給予等量溶媒灌胃,干預(yù)治療8周。留取大鼠血、尿、腎組織標(biāo)本,觀察以下指標(biāo)包括

5、腎重、腎重/體重比、血糖、血肌酐、尿肌酐、尿量、腎臟病理形態(tài)學(xué)、腎臟超微結(jié)構(gòu)、腎組織總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)等。間接免疫熒光法觀察nephrin在腎小球內(nèi)的分布特點(diǎn)。免疫組化法檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、Toll樣受體(Toll-like-receptor,TLR)2、TLR4、骨橋蛋白(OPN)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、E-鈣粘附

6、蛋白(E-cad)、波形蛋白(Vim)、ED-1、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)、NF-κB-p-p65等蛋白在腎組織內(nèi)的表達(dá)分布情況。免疫組化雙染檢測PCNA/ED-1、p-STAT3/ED-1、TLR2/ED-1、TLR4/ED-1陽性細(xì)胞在腎組織內(nèi)的分布情況。Western印跡法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)、白細(xì)胞介素-

7、1(IL-1)、NF-κB-p65、Ⅳ型膠原、3-硝基酪氨酸(3-NT)、nephrin、磷酸化p38MAPK(p-p38),磷酸化JAK2(p-JAK2)、磷酸化STAT3(p-STAT3)等蛋白在腎組織內(nèi)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　模型組大鼠24h尿白蛋白排泄率(UAER)明顯高于對照組(P<0.01),TGP給藥組UAER較模型組明顯降低(P<0.01)。模型組大鼠表現(xiàn)為血糖升高、體重下降、相對腎重增加,TGP(50

8、,100,200mg/kg.d)給藥對大鼠血糖升高與體重下降沒有明顯的影響(P﹥0.05)。模型組大鼠腎小球體積明顯高于對照組(P<0.01),TGP(100,200mg/kg.d)給藥組腎小球體積較模型組明顯減小(P<0.05,P<0.01)。TGP給藥組腎臟超微結(jié)構(gòu)的病變較模型組明顯改善。TGP(100,200mg/kg.d)給藥組腎小管-間質(zhì)損傷指數(shù)(TII)明顯低于模型組(P<0.05,P<0.01)。TGP(50,100,20

9、0mg/kg.d)給藥組腎組織內(nèi)ICAM-1、TNF-α、IL-1、NF-κB-p65、Ⅳ型膠原等蛋白表達(dá)水平較模型組均有明顯下降,其中ICAM-1分別下降47.9％、60.4%、72.9%,TNF-α分別下降46.5%、86%、93.8%,IL-1分別下降77.7%、86.4%、88.6%,NF-κB-p65分別下降38.4%、53%、59%,Ⅳ型膠原分別下降47.9%、60.4%、72.9%。模型組大鼠腎組織中TLR2、TLR4表達(dá)

10、明顯高于對照組(P<0.01)。與模型組相比,TGP(50、100、200mg/kg·d)給藥8周對腎小球TLR2表達(dá)無明顯影響,腎小管-間質(zhì)TLR2表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)。TGP(50、100、200mg/kg·d)給藥組腎小球與腎小管-間質(zhì)TLR4表達(dá)均明顯低于模型組(P<0.01)。
　　與對照組相比、模型組腎組織內(nèi)T-AOC、SOD、CAT活性明顯降低(P<0.01),TGP(200mg/kg.d)給藥組T-A

11、OC、SOD、CAT活性明顯高于模型組(P<0.01)。TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組腎組織內(nèi)3-NT、p-p38蛋白表達(dá)水平較模型組明顯下降,NT分別下降41.2%、43.8%、57.5%,p-p38分別下降30.8%、24%、60.1%。免疫熒光發(fā)現(xiàn)對照組腎小球內(nèi)nephrin呈線狀均勻分布,模型組nephrin表達(dá)明顯減小、呈顆粒狀不均勻分布,TGP給藥組nephrin表達(dá)部分恢復(fù)。TGP(50,100,200

12、mg/kg.d)給藥組nephrin蛋白表達(dá)較模型組分別增加25.2%、89.2%、73.9%。
　　模型組大鼠腎小管-間質(zhì)E-cad蛋白表達(dá)明顯低于對照組(P<0.01),TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組腎小管-間質(zhì)E-cad蛋白表達(dá)明顯高于模型組(P<0.01);模型組腎小管-間質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01),TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組腎小管-間質(zhì)α-SMA蛋白表達(dá)

13、明顯低于模型組(P<0.01);模型組腎小管-間質(zhì)Vim蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01),TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組腎小管-間質(zhì)Vim蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01);模型組腎小管-間質(zhì)OPN蛋白表達(dá)明顯高于對照組(P<0.01),TGP(100,200mg/kg.d)給藥組腎小管-間質(zhì)OPN蛋白表達(dá)明顯低于模型組(P<0.01)。
　　模型組大鼠腎組織內(nèi)PCNA+細(xì)胞數(shù)、ED-1+細(xì)胞數(shù)、p-

14、STAT3+細(xì)胞數(shù)、PCNA+/ED-1+細(xì)胞數(shù)、p-STAT3+/ED-1+細(xì)胞數(shù)、TLR2+/ED-1+細(xì)胞數(shù)、TLR4+/ED-1+細(xì)胞數(shù)、NF-κB-p-p65+細(xì)胞數(shù)均明顯高于對照組(P<0.01)。TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組PCNA+、ED-1+、p-STAT3、PCNA+/ED-1+、p-STAT3+/ED-1+、TLR2+/ED-1+、TLR4+/ED-1+、NF-κB-p-p65+陽性細(xì)胞數(shù)均較

15、模型組明顯減少(P<0.01)。模型組腎組織內(nèi)p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均顯著高于對照組(P<0.01),TGP(50,100,200mg/kg.d)給藥組使p-JAK2蛋白分別下降22.3%、50.5%、43.2%,使p-STAT3蛋白分別下降20.9%、61.1%、42.3%。
　　結(jié)論：
　　TGP對STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的早期腎損害有明顯的保護(hù)作用。TGP可能是通過以下多種機(jī)制如抑制腎內(nèi)炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激損