1、食管癌是常見的惡性消化道腫瘤，全世界每年約有30萬人死于食管癌。我國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一，食管癌位居我國腫瘤死亡的第4位，每年平均病死約15萬人。食管癌多為鱗癌，是一種侵襲性很強的腫瘤，它的預(yù)后差，臨床進展迅速，多伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，且易復(fù)發(fā)。早期食道癌治療方法主要是手術(shù)治療和放射治療，由于種種原因食道癌發(fā)現(xiàn)大多已中晚期，早已不宜手術(shù)，因此中晚期食管癌治療多以放化療相結(jié)合的綜合性治療辦法。
　　隨著腫瘤研究的深入，人們逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤

2、也是一種干細胞病，目前在多種腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了干細胞，如乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌等，2005年日本科學(xué)家在食管癌中也發(fā)現(xiàn)了干細胞。由于腫瘤干細胞的存在，使得化療效果不盡如人意，因為腫瘤干細胞和干細胞一樣具有極強的耐藥性，化療藥物僅能殺死普通的腫瘤細胞，而不能殺死腫瘤干細胞，由于腫瘤干細胞的自我更新、增值、分化，會形成新的腫瘤組織，從而引起腫瘤的復(fù)發(fā)。如果能夠針對腫瘤干細胞用藥，殺死腫瘤干細胞，腫瘤就會逐漸消亡，最終消失，從而取得治療成功。因

3、此腫瘤干細胞是腫瘤治療中的一個有效的靶點。
　　要對腫瘤干細胞進行研究，首先就要將其從腫瘤細胞中分離出來，并給以鑒定，目前在腫瘤干細胞的分離中，多采用以下三種方法：1、流式細胞儀分選法；2、磁性分選儀分選法；3、側(cè)群細胞（side-population cells，SP細胞）分選法，其中前兩者是利用腫瘤細胞的特異性表面標(biāo)志物，將其與相對應(yīng)的抗體結(jié)合，使用流式細胞儀或磁性分選儀將其分選出來，而SP細胞分選法則是利用SP細胞與腫瘤干細

4、胞具有較多的共性，SP細胞被認為是具有干細胞樣的細胞群落，在某些沒有發(fā)現(xiàn)特異性標(biāo)志物的腫瘤中，由于無法通過前兩種方法分選出腫瘤干細胞，SP細胞就會通過使用流式細胞儀分選出，來作為研究腫瘤干細胞的替代品，但SP細胞只是具有干細胞樣的細胞，并不能認為SP細胞就是腫瘤干細胞。
　　對以上三種分選方法進行比較，SP細胞分選法，具有適用性廣泛，試劑價格低廉的優(yōu)點，目前在食管癌、胃癌、甲狀腺癌等腫瘤中分選出了SP細胞，但這種方法前期準備工作復(fù)

5、雜，且由于在分選過程中使用到了有毒性的熒光染料，所以分選出的細胞活性差，難以存活。因此在腫瘤干細胞的分選中，尋找特異性的表面標(biāo)志物，仍是無法繞過去的難題。目前在多種腫瘤細胞株中找到的特異性表面標(biāo)志物，如 CD44+CD24-/low的乳腺癌細胞被認為是乳腺癌干細胞， CD133+表型的腦腫瘤細胞被命名為腦腫瘤干細胞，但在食管癌中尚未能發(fā)現(xiàn)特異性的表面標(biāo)志物。
　　P75NTR（P75 neurotroph in receptor，

6、P75NTR）是一個神經(jīng)影響因子受體，表達于在神經(jīng)細胞的早期發(fā)育過程中，其通過不同信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)以神經(jīng)細胞為主的細胞增殖、遷移、分化、凋亡、突觸的建立及神經(jīng)的形成。近年來在食管癌研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，P75NTR陽性細胞具有無限增殖、自我更新和多向分化的能力，而這些特點與腫瘤干細胞極其相似，因此認為 P75NTR可能是食管癌干細胞的特異性表面標(biāo)志物，但后續(xù)的研究顯示：p75NTR不能單獨作為人食管腫瘤干細胞表面標(biāo)志物，其原因為：1.部分

7、食管癌細胞株中 p75 NTR陽性細胞高達30.1％，遠高于腫瘤干細胞正常比例。2.它的陰性細胞也有一定成瘤能力。結(jié)合目前腫瘤干細胞表面標(biāo)志物多為一個腫瘤細胞標(biāo)志物與一個干細胞標(biāo)志物相聯(lián)合，我們考慮為p75 NTR找一個搭檔，首先它必須是膜蛋白，還是一個干細胞的標(biāo)志物，其次考慮腫瘤干細胞的多藥耐藥性，它最好是一個耐藥蛋白。
　　乳腺癌耐藥蛋白（Breast cancer resistance protein1， BCRP1）是SP

8、細胞主要的轉(zhuǎn)運蛋白，它是一個膜蛋白，其轉(zhuǎn)運能力較P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多藥耐藥相關(guān)蛋白（ Multidrug related protein， MRP）、肺相關(guān)蛋白（ Lung relatedprotein，LRP）、熱休克蛋白（Hot shock protein，HSP）等其他耐藥蛋白高出5-50倍，且BCRP1在不同來源的SP中均呈高表達，其功能被認為是參與腫瘤細胞的多藥耐藥性，因此被認為是一個干細胞

9、的標(biāo)志物。
　　為觀察P75NTR與BCRP1聯(lián)合能否作為食管癌干細胞表面標(biāo)志物，本研究使用流式細胞儀在食管癌TE-2細胞株中分選出SP細胞與非SP細胞亞群，使用磁性分選儀分選出p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞，然后通過觀察p75NTR+/BCRP1+細胞在細胞增值能力、分化能力、體外成瘤能力、細胞腫瘤球形成情況與陰性細胞的差異，并通過比較其與 SP細胞在以上方面的差異，判斷 p75NTR與BCRP1聯(lián)合作為TE-

10、2細胞株干細胞標(biāo)志物的可能，從而為食管癌的臨床治療提供有效的靶點。
　　方法：
　　1、常規(guī)方法培養(yǎng)食管癌TE-2細胞株。
　　2、流式細胞術(shù)檢測 CD133、CD44、CD24、BCRP1、BCRP2、P75NTR在食管癌TE-2細胞株中的表達。
　　3、流式細胞法分選食管癌TE2細胞株中的SP細胞亞群與非SP細胞亞群。
　　4、磁性分選法分選食管癌TE2細胞株中p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰

11、性細胞。
　　5、MTT法檢測SP細胞亞群、非SP細胞亞群、p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞的增殖能力。
　　6、Transwell實驗檢測SP細胞亞群、非SP細胞亞群、p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞侵襲能力。
　　7、Transwell實驗檢測SP細胞亞群、非SP細胞亞群、p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞遷移能力。
　　8、通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期，觀察各組細

12、胞的分化能力。
　　9、裸鼠致瘤實驗觀察SP細胞亞群、非SP細胞亞群、p75NTR+/ BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞的體內(nèi)致瘤性。
　　10、流式細胞術(shù)檢測SP細胞亞群、非SP細胞亞群、p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與陰性細胞的耐藥性。
　　11、采用SPSS10.0進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用單因素方差分析，以α＝0.05為檢驗水準，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、流式熒光檢測顯示

13、：CD133、CD44、CD24在食管癌細胞株TE-2中均無陽性表達，BCRP2在食管癌細胞株 TE-2中的陽性表達為9.4%-11.7%，遠超出腫瘤干細胞在腫瘤細胞中應(yīng)有的比例，P75NTR與 BCRP1在食管癌細胞株 TE-2中的陽性表達為1.1%-3.0%及1.5%-1.9%，符合腫瘤干細胞在腫瘤細胞中應(yīng)有的比例。
　　2、流式熒光檢測連續(xù)傳代的TE-2中SP細胞的陽性表達，TE-2細胞中的 SP細胞比例約為0.8%。

14、>　　3、MACS篩選的 p75 NTR+/ BCRP1+雙陽性細胞的純度為86.1%，得率為0.52%。
　　4、通過MTT法檢測各組細胞的增殖能力，結(jié)果顯示：在第一天各組細胞間的增殖能力均無顯著差異；在第二天即出現(xiàn)顯著性差異，其中非SP細胞組與陰性細胞組增殖情況一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.227）；SP細胞顯著高于非SP細胞，P=0.019；p75NTR+/ BCRP1+雙陽性細胞顯著高于陰性細胞，P=0.018；在隨后的

15、第三天至第六天，差異依然存在；SP細胞組與雙陽性細胞組增殖速度一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.208）。
　　5、通過細胞計數(shù)法檢測各組細胞的增殖能力，結(jié)果顯示：非SP細胞組與陰性細胞組增殖情況一致；SP細胞的增殖速度遠高于非SP細胞；p75 NTR+/BCRP1+雙陽性細胞的增殖速度遠高于陰性細胞；SP細胞組與p75 NTR+/ BCRP1+雙陽性細胞組增殖速度一致。
　　6、通過 Transwell法檢測各組細胞侵襲能力

16、，結(jié)果顯示：非 SP細胞組與陰性細胞組穿過 ECM膠聚碳酸酯數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.182）；SP細胞穿過 ECM膠聚碳酸酯數(shù)多于非SP細胞，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.021)；p75 NTR+/BCRP1+雙陽性細胞穿過膠聚碳酸酯數(shù)多于陰性細胞，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019)。p75 NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與SP細胞相比較，二者無顯著性差異(P=0.27)，表明SP組與p75 NTR+/ B

17、CRP1+雙陽性組細胞具有更強的侵襲能力。
　　7、通過Transwell法檢測各組細胞遷移能力，結(jié)果顯示：SP細胞穿過濾膜數(shù)多于非SP細胞，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.031)；雙陽性細胞穿過濾膜數(shù)多于陰性細胞，兩者相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.025)；p75 NTR+/BCRP1+雙陽性細胞與SP細胞相比較，二者無顯著性差異（P=0.19）。
　　8、通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期，觀察各組細胞的分化能力，結(jié)果顯

18、示：SP細胞組與p75 NTR+/BCRP1+雙陽性細胞組的分化能力強于非SP細胞組與陰性細胞組。
　　9、通過接種移植瘤觀察各組細胞體內(nèi)成瘤能力，結(jié)果顯示：當(dāng)植入1×103個SP細胞或p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞，4周就可以觀察到明顯的新生腫瘤塊；而即使植入1×105個非SP細胞或陰性細胞，在第14周仍未能形成腫瘤塊。
　　10、通過羅丹明積蓄和泵出實驗觀察耐藥性，結(jié)果顯示：SP細胞、非SP細胞、p75 NTR+

19、/BCRP1+雙陽性細胞組和陰性組在TE-2細胞內(nèi)Rho123的熒光強度分別為11.5±0.3、81.7±7.3、10.7±0.2和82.3±0.5，SP細胞與非SP細胞相比較，差異有顯著性（P=0.024），p75 NTR+/BCRP1+雙陽性組與陰性組相比較，差異有顯著性（P=0.027）。說明在SP和p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞中，大部分羅丹明蓄積較少，而非SP細胞與陰性細胞內(nèi)若丹明蓄積較多。在羅丹明泵出試驗中，結(jié)果顯示

20、：SP細胞、非SP細胞、雙陽性細胞組和陰性組，TE-2細胞內(nèi)Rho123的熒光強度分別為11.5±0.3、81.7±7.3、10.7±0.2和82.3±0.5，SP細胞與非SP細胞相比較，差異有顯著性（P=0.026），雙陽性組與陰性組相比較，差異有顯著性（P=0.018）。說明在SP和p75NTR+/BCRP1+雙陽性細胞中，大部分羅丹明被轉(zhuǎn)運出細胞，而非SP細胞與陰性細胞內(nèi)的羅丹明排除較少。
　　結(jié)論：
　　p75NTR