1、本文研究目的：系列觀察研究經(jīng)冠狀動脈內(nèi)注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)治療急性心肌梗死(AMI)的療效，并比較放射性心肌核素顯像、經(jīng)胸超聲心動圖和心臟電機械標(biāo)測測定存活心肌的特異性及敏感性。 方法： (一)實驗研究：選用雄性家豬(購自于江蘇省農(nóng)科院畜牧研究院)，體重介于20--30kg。以球囊封堵左冠狀動脈前降支制作心肌梗死模型，觀察24h后，存活者按心肌梗死造模次序隨機分為治療組和對照組。氯氨酮(25mg/kg，IM)

2、麻醉后，在無菌條件下，用含肝素6000u的注射器抽取髂骨骨髓30m1。用FicoU-Paque(1．077g／mi)分離液分離出單個核細(xì)胞，1500rpm離心10min，洗兩次，將離心后的細(xì)胞打散并以1×107個／mi細(xì)胞接種在75cm2的培養(yǎng)瓶內(nèi)。l天后去掉懸浮細(xì)胞，每3天換液，7．10天后當(dāng)細(xì)胞近融合時，0．125％的胰酶消化，1000rpm離心5min，生理鹽水洗2次，取l×lO7擬行注射的細(xì)胞，100目濾網(wǎng)過濾，重懸于含肝素20

3、00u的5mi生理鹽水備用。標(biāo)記方法應(yīng)用嘧啶的類似物溴化脫氧尿嘧啶(BrdU,Sigma公司)或熒光PKH26(Sigma公司)，注射前2天，在培養(yǎng)液中加入10psnol／L的BrdU；部分豬，在注射前，給其MSC進(jìn)行PKH26熒光染色。用間接免疫熒光法檢細(xì)胞的表型。在心梗前、注入MSC前、處死前三個時間點，插入豬尾巴導(dǎo)管，連接壓力換能器，記錄左室收縮壓(LVSP，leftventricularsystolicpressure)、左室舒

4、張末壓(LVEDP，leftend-diastolicpressure)、壓力升高最大速率(+dP／dt，peakrate0fpressurerise)和壓力下降最大速率(．dP／dt，peakrateofpressurefall)，每次記錄前需穩(wěn)定15min。 在處死前，麻醉后送入核素室，靜脈注射99Tcm-MIBI顯像，行心電檢測，行心肌核素顯像檢查，檢測梗塞相對面積、心肌灌注評分以及左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。MSC注入1月

5、后，心內(nèi)注射氯化鉀處死動物，取出心臟，取心梗周圍組織，部分送查PKH26熒光，大部分在10％中性甲醛固定，石蠟包埋，切片后行HE染色和免疫熒光檢測。血管密度的計算是，在400倍光學(xué)顯微鏡下(0．2mm2)，隨機觀察瘢痕組織處5個視野的毛細(xì)血管數(shù)，取其平均值。 (二)不同方法測定存活心肌的比較研究：15例急性心肌梗死患者入選本研究。入選標(biāo)準(zhǔn)為：持續(xù)性胸痛發(fā)生時間<12h，無心腔內(nèi)附壁血栓，不合并主動脈瓣狹窄，無合并心源性休克及嚴(yán)重

6、心律失常，冠狀動脈造影證實為單支病變，患者具有經(jīng)濟(jì)承擔(dān)能力。 分別在左前斜30。和右前斜30。獲得左心室造影的圖像后，開始心臟電機械標(biāo)測(NOGA)，標(biāo)測導(dǎo)管有系列型號可供選擇(根據(jù)患者的身高來確定導(dǎo)管的型號)，同時測定單極電壓(Uvp)和局部線性內(nèi)膜短縮率(LLS)。全部標(biāo)測結(jié)束后，退出標(biāo)測導(dǎo)管，術(shù)后4～6h拔出動脈鞘并局部加壓包扎。局部機械活性以LLS表示，其計算公式為LS=(LiED-LiEs／LIED)x100。經(jīng)皮冠狀

7、動脈介入治療術(shù)后第7天早晨，標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)下進(jìn)行心計核素灌注及代謝顯像。標(biāo)準(zhǔn)位置包括左心室短軸，水平長軸及垂直長軸。按照灌注及代謝之間匹配的關(guān)系計算存活及壞死心肌的面積(cmz)。門控測定左心室直徑及射血分?jǐn)?shù)。 (三)臨床研究：急性心肌梗死持續(xù)性胸痛發(fā)病在12小時內(nèi)且愿意接受骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的患者共計108例，PCI術(shù)成功后即刻向患者及家屬詳細(xì)交代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞心肌內(nèi)移植的目的及方法，獲取家屬知情同意后上報院學(xué)術(shù)委員會批準(zhǔn)通過后

8、開始下述診療程序。入選標(biāo)準(zhǔn)包括年齡<70歲，無心源性休克和心臟阻滯，血流動力學(xué)穩(wěn)定，不伴有其他合并癥(如糖尿病，腎功能不全等)。最終，78例患者中有69例符合上述標(biāo)準(zhǔn)并入選本研究，對入選后的患者立即進(jìn)行隨機分組，接受骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植的陽性實驗組包括34例(BMSC組)，注射生理鹽水的對照組為35例患者(PCI組)。術(shù)前一日和術(shù)后3個月，6個月所有患者均接受18．FDG—SPECT，心導(dǎo)管及經(jīng)胸超聲檢查，分別測定存活心肌和心室功能。術(shù)

9、后所有患者均進(jìn)入監(jiān)護(hù)病房持續(xù)監(jiān)護(hù)24小時，臨床隨訪時間至少6個月，隨訪終點是心源性死亡。 結(jié)果： (一)實驗研究：細(xì)胞周期結(jié)果顯示，約92．00％細(xì)胞處在G0／G1期，而處在G2-M期和S期的細(xì)胞分別為4．74％和3．25％。和對照組相比，治療組LVSP(87．1~8．7mmHg對78．0~4．4mmHg，p<0．05)、+dp／dr(1818．1~116．7mmHg/s對1610．6~114．5mnHg/s，p<0．0

10、1)和-dp／dt(1800．9~88．5mmHg/s對1618．4~65．7mnHg/s，p<0．01)顯著增加，LVEDP(9．4~1．7mmHg對12．6~2．8mmHg，p<0．05)顯著降低，心功能得以改善。治療組和對照組相比，心肌灌注評分(30．0~5．3對41．8士8．8，p<0．01)和相對心梗面積[(28．6~4．7)％對(33．5~3．4)％，p<0．05】顯著降低，左心室射血分?jǐn)?shù)【(44．1~4．3)％對(39．0

11、~5．2)％，p<0．05】顯著增加。心臟大體標(biāo)本可見，治療組梗塞面積較對照組明顯縮小。HE染色可見，治療組與對照組相比：纖維組織減少，毛細(xì)血管密度增加[(6．0~13)根／0．2mm2對(4．5~0．9)根／0．2mm2，p<0．05】，未見脂肪和骨骼組織沉積、未見腫瘤組織。免疫熒光檢測顯示，在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞中可見BrdU陽性細(xì)胞，提示MSC已植入并植活。BrdU陽性細(xì)胞已分化為心肌細(xì)胞，并和原心肌細(xì)胞有縫隙連接形成，

12、BrdU陽性細(xì)胞也可分化為血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞。 (二)存活心肌的測定結(jié)果：在NOGA過程中，常見室性心律失常，尤其是當(dāng)標(biāo)測導(dǎo)管頭端與心內(nèi)膜接觸過緊時，減小導(dǎo)管頭端的張力后心律失?？梢宰詣酉Ф恍枰剐穆墒СＫ幬镏委?。第4例患者在標(biāo)記結(jié)束后30min出現(xiàn)心包壓塞，經(jīng)過心包引流后血流動力學(xué)穩(wěn)定，轉(zhuǎn)送外科修補后康復(fù)出院。每例患者的平均標(biāo)測時間為(50~12)min，需要X線引導(dǎo)透視的時間平均為(22±7)min。 超聲心動

13、圖共計測定78個階段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)24．6％階段運動正常，43％為低運動區(qū)，27．8％為無運動區(qū)域，而反常運動見于4．4％)。當(dāng)超聲圖像與心臟電機械活性標(biāo)測結(jié)合時，運動正常區(qū)域心肌的心內(nèi)膜下心肌短縮率(LLS)最高達(dá)(10．4~5)％，而低運動和無運動區(qū)域分別為(7．3~6)％和(4．3~5)％，同時測得反常運動區(qū)域最低達(dá)0．215％。但是無運動和反常運動區(qū)域之間的LLS無顯著性差異。 根據(jù)心臟超聲心動圖和核素心肌顯像的結(jié)果，將左心

14、室分為如下幾個部分并比較心臟電機械標(biāo)測的單極電壓，發(fā)現(xiàn)運動正常及低運動區(qū)域的UVP分別為(10．9't：3)mV和(9．44-3)mV(p>0．05)，而且均顯著高于反常運動及運動消失區(qū)域(6．84-3mV，p<0．05)。最重要的現(xiàn)象是不同運動區(qū)域心肌UVP數(shù)值之間重疊明顯。ROC曲線分析表明曲線下面積為0．85(95％可信限區(qū)間為0．77-0．92)，UVP界定值>8．0mV是區(qū)別存活與壞死心肌的最佳參考值(敏感性及特異性均為73％

15、)。 (三)臨床研究：BMSC和PCI對照組之間的基線臨床特征之間差異無顯著性，BMSC組患者血清CK—MB的水平略高于對照組，但統(tǒng)計學(xué)差異無顯著性。 BMSC組3個月時左心室造影見心室運動異常(運動減弱，無運動及反常運動)比例顯著降低(13±5vs32±11％)，同時顯著低于PCI對照組3個月時的測定值(13±5vs28±10％)。BMSC組左心室梗死區(qū)域室壁運動速度顯著增加(2．17±1．3vs4．2±2．5cm／s

16、)，而PCI對照組幾無改善(2．19±I．5vs2．7±1．7cm／s)。BMSC組術(shù)后3個月內(nèi)左心室射血分?jǐn)?shù)持續(xù)改善，與術(shù)前及PCI對照組之間差異顯著(67±U％vs49±9％和53±8％)，但是術(shù)后6個月與3個月之間相比較差異無顯著性。BMSC組術(shù)后3個月時SPECT測定的灌注缺損面積顯著低于PCI對照組(134±66vs185±87cmL)，同時左心室舒張末期容積(162±27vs136±3lmL)及收縮末期容積(88±19vs6

17、3±20mL)也顯著降低，左心室收縮末期壓力與容積的比值(Psyst/ESV)降低顯著(1．72±1．23vs2．84±1．30mmHg/mL)。隨訪期內(nèi)未見致命性心律失常發(fā)生。心臟電機械標(biāo)測結(jié)果表明BMSC組術(shù)后3個月時梗死區(qū)域心肌內(nèi)膜縮短率(LLS)顯著增強(7．32±1．86vs11．29±1．64％)，而心內(nèi)膜單極電壓(U'V)水平同步增加(7．61±1．09vs10．38±1．12mv)；灌注缺損面積下降(36．2±6．2％t