1、目的 在建立小型豬骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemceUs．MSCs)的體外分離和培養(yǎng)方法的基礎(chǔ)上探討小型豬心導(dǎo)管介入冠狀動(dòng)脈治療模型，觀察自體MSCs經(jīng)心導(dǎo)管介入冠狀動(dòng)脈移植后在心肌內(nèi)的遷移及分化情況，為MSCs移植治療心血管疾病提供切實(shí)可行的方法。 方法 選用心臟及冠狀動(dòng)脈解剖生理特點(diǎn)與人類相似的小型豬，穿刺小型豬的髂后上嵴抽取骨髓，經(jīng)密度梯度法離心得到骨髓單個(gè)核細(xì)胞，接種后形成單層貼壁細(xì)胞，

2、通過(guò)換液和傳代純化MSCs，用形態(tài)學(xué)方法鑒定培養(yǎng)的MSCs。待MSCs擴(kuò)增達(dá)到10?！?0。時(shí)，經(jīng)DAPI標(biāo)記后應(yīng)用心導(dǎo)管技術(shù)將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的小型豬自體MSCs移植進(jìn)入左冠狀動(dòng)脈前降支。用免疫熒光檢測(cè)即刻移植和移植后6w移植細(xì)胞的細(xì)胞肌鈣蛋白T(CardiacTroponinT，cTnT)、縫隙連接蛋白43(connexin43，Cx43)、anti一Ⅷfactor的表達(dá)。 結(jié)果 經(jīng)培養(yǎng)存活的MSCs原代和一代呈紡錘型、

3、多邊型或星型。至二代起呈均一紡錘型，似成纖維細(xì)胞樣，長(zhǎng)寬比例約為2～3：1。體外培養(yǎng)的原代MSCs8～10d達(dá)到融合，傳代后仍具有較強(qiáng)的增殖能力。經(jīng)心導(dǎo)管介入冠狀動(dòng)脈成功進(jìn)行了自體MSCs移植，且移植細(xì)胞存活，MSCs自冠狀動(dòng)脈移植處向心肌組織遷移，分散分布；部分MSCs向心肌細(xì)胞方向分化，局部心肌組織出現(xiàn)新生毛細(xì)血管；未見(jiàn)炎癥及排斥反應(yīng)。對(duì)照即刻組MSCs聚集成團(tuán)狀，未有遷移及分化出現(xiàn)。 結(jié)論 小型豬MSCs可在體外分

4、離、純化、擴(kuò)增；應(yīng)用心導(dǎo)管術(shù)進(jìn)行自體MSCs移植成功，并可進(jìn)行準(zhǔn)確的定位和動(dòng)態(tài)觀測(cè)，為臨床應(yīng)用提供了一個(gè)可靠的技術(shù)平臺(tái)。自體移植后的MSCs在心肌內(nèi)存活，并且在多種因素的作用下可以從移植處向心肌組織內(nèi)遷移，部分細(xì)胞發(fā)生分化。 目的 體外以成年Wistar大鼠為研究對(duì)象，觀察5一氮雜胞苷(5-azacyt塒ine，5-aza)誘導(dǎo)MSCs分化為心肌樣細(xì)胞的分化率以及MSCs向神經(jīng)細(xì)胞和骨細(xì)胞分化的情況，確認(rèn)MSCs

5、含有不同組織類型的定向干細(xì)胞。 方法 以成年Wistar大鼠為研究對(duì)象，體外分離、純化、培養(yǎng)大鼠MSCs，將原代MSCs接種在裝有蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿玻片90％～95％后，用5-aza(終濃度為10umol／L)誘導(dǎo)24h。DAPI標(biāo)記細(xì)胞，每張爬片隨機(jī)選取6個(gè)非重復(fù)視野，用免疫熒光方法動(dòng)態(tài)檢測(cè)誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后24h、3d、1w、2w、4w的cTnT、Cx43的表達(dá)。同時(shí)建立空白對(duì)照組(培養(yǎng)基中不加誘導(dǎo)劑)，c

6、TnT、Cx43。設(shè)立實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，與誘導(dǎo)組同一時(shí)間點(diǎn)動(dòng)態(tài)檢測(cè)巢蛋白(Nestin)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NeuronSpecificEndolase，NSE)、I型膠原蛋白(CollagenTypeI，CTI)的表達(dá)，用改良Kaplow氏法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(intra—cellularalkalinephosphatases，CAKP)的表達(dá)，分別計(jì)算cTnT、Cx43、Nestin、NSE、CTI、CAKP的表達(dá)百分比及其變化情

7、況，并在倒置顯微鏡下觀察誘導(dǎo)前后細(xì)胞形態(tài)的變化及對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)的變化。 結(jié)果 體外實(shí)驗(yàn)中，誘導(dǎo)后細(xì)胞胞體增長(zhǎng)，胞漿增多，有多個(gè)分叉，形態(tài)和個(gè)數(shù)各不相同，細(xì)胞之間出現(xiàn)連接，細(xì)胞排列趨向一致，但未觀察到自發(fā)搏動(dòng)，cTnT在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后24h、3d、1w、2w、4w的平均表達(dá)率依次為0、2．9％、8．5％、11．8％、22．2％、32．6％；Cx43在誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后24h、3d、1w、2w、4w的平均表達(dá)率依次為O、3．9％

8、、8．1％、16．4％、23．6％、34．6％?？瞻讓?duì)照組(未誘導(dǎo))中只有少量細(xì)胞形態(tài)上胞體增長(zhǎng)，出現(xiàn)分叉，呈現(xiàn)心肌樣細(xì)胞特點(diǎn)，cTnT的平均表達(dá)率依次為：O、0、O、2．1％、4．1％、6．6％；Cx43的平均表達(dá)率依次為：O、0、0、2．2％、4．1％、7．1％；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組中少量細(xì)胞形態(tài)上呈圓形，立題感增強(qiáng)，有突觸出現(xiàn)，呈現(xiàn)神經(jīng)樣細(xì)胞特點(diǎn)，Nstin的平均表達(dá)率依次為0、0、0、2．7％、5．2％、6．9％；NSE的平均表達(dá)率依次為

9、O、0、0、L7％、2．8％、6．5％；少量細(xì)胞形態(tài)上多邊形，連接緊密，胞體立方形或矮柱狀形，表面有許多細(xì)小突起，呈現(xiàn)骨樣細(xì)胞特點(diǎn)，I型膠原蛋白的平均表達(dá)率依次為0、0、0、1．9％、3．9％、6．2％，CAKP的平均表達(dá)率依次為0、0、O、O、1．9％、4．4％。 結(jié)論 MSCs是非均質(zhì)性的，其中可能含有不同分化方向的干細(xì)胞亞群，即含有向不同組織細(xì)胞分化的定向干細(xì)胞群，其具有潛在的分化為相應(yīng)組織細(xì)胞的能力。