1、第一部分，目的:
　　 苯丙酮尿癥(Phenylkctonuria,PKU)是一種嚴(yán)重的氨基酸代謝障礙性疾病,呈常染色體隱性遺傳。PKU主要是由于體內(nèi)苯丙氨酸羥化酶(Phenylalaninehydroxylase,PAH)活性喪失,導(dǎo)致苯丙氨酸不能正常轉(zhuǎn)化為酪氨酸而蓄積在體內(nèi),引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,同時(shí)造成酪氨酸、多巴、腎上腺素、黑色素等生理活性物質(zhì)的合成障礙,帶來一系列的病理改變。該病發(fā)病率平均為1/11000,主要表現(xiàn)有

2、智力發(fā)育遲緩、色素減少、尿液中含有大量的苯丙酮酸。目前已經(jīng)證實(shí)PAH基因的點(diǎn)突變、缺失/重復(fù)突變會(huì)導(dǎo)致PAH活性降低或失活。PAH基因定位于12q22-q24.1,由125kb組成,含有13個(gè)外顯子,轉(zhuǎn)錄1356bp的mRNA,翻譯成含452個(gè)氨基酸殘基的酶單體,4個(gè)酶單體聚合成有功能的苯丙氨酸羥化酶,參與苯丙氨酸的代謝。PAH基因可有多種突變類型,以錯(cuò)義突變?yōu)橹?這些突變可發(fā)生在外顯子、內(nèi)含子、5'-UTR和3'-UTR區(qū)域。

3、　　 我室采集了26例典型PKU患者血樣,聯(lián)合運(yùn)用HRM、MLRA、DNA測序等方法進(jìn)行PAH基因突變篩查,相對(duì)提高了PAH基因突變篩查的檢出率,研究結(jié)果對(duì)PKU患者的基因診斷和產(chǎn)前診斷以及探討可能的基因治療有十分重要的意義。
　　 材料與方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 26例典型苯丙酮尿癥患者,由沈陽市婦女兒童保健中心提供,在家屬知情同意情況下,抽取患者外周靜脈血1～2ml。正常對(duì)照DNA樣品來自實(shí)驗(yàn)室收集

4、的健康無血緣關(guān)系體檢個(gè)體。
　　 二、方法
　　 1、提取基因組DNA
　　 使用試劑盒UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0提取患者及正常對(duì)照外周靜脈血基因組DNA。
　　 2、應(yīng)用HRM結(jié)合DNA測序技術(shù)篩查PAH基因點(diǎn)突變
　　 參考SaskiaBrautigam文獻(xiàn)中的引物,加入熒光染料LCGreen分別擴(kuò)增PAH基因全部外顯子。對(duì)PCR產(chǎn)物采用HR

5、M的單通道高分辨率熔解曲線突變檢測系統(tǒng)(Idaho,USA)檢測,應(yīng)用HRM應(yīng)用分析軟件(LightScannerAnalysisSoftware)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)陽性結(jié)果采用DNA測序驗(yàn)證,確認(rèn)突變的確切位點(diǎn)。
　　 3、應(yīng)用MLPA技術(shù)篩查PAH基因缺失/重復(fù)突變
　　 使用針對(duì)PAH基因13個(gè)外顯子特定序列設(shè)計(jì)的SALSAMLPAKITP055-B1PAH試劑盒(MRC,Holland),對(duì)模板基因組DNA進(jìn)行雜交

6、、連接、PCR反應(yīng),借助BeckmanCEQ-8000遺傳分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,所得數(shù)據(jù)經(jīng)BeckmanCEQ-8000遺傳分析儀的FragmentAnalysis軟件分析得到原始峰圖,再使用CoffalyserVersion9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算出被檢測樣本的每個(gè)外顯子的拷貝數(shù)的相對(duì)峰面積比(relativepeakratio,RPR),得出對(duì)應(yīng)外顯子的直方圖。
　　 4、應(yīng)用PCR-RFLP方法進(jìn)行

7、驗(yàn)證分析
　　 查閱人類突變數(shù)據(jù)庫(HGMD),對(duì)檢測出的未報(bào)道突變,驗(yàn)證是否為單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidPolymorphism,SNP),設(shè)計(jì)錯(cuò)配引物,錯(cuò)配堿基與包.括突變堿基在內(nèi)的鄰近堿基構(gòu)成對(duì)應(yīng)限制性酶切位點(diǎn),應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng).限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)的方法對(duì)患者

8、及73名無關(guān)正常個(gè)體使用錯(cuò)配引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,限制性內(nèi)切酶酶切后,產(chǎn)物經(jīng)8%中性聚丙烯酰胺凝膠電泳和常規(guī)銀染檢測。
　　 結(jié)果：
　　 1、HRM分析及測序結(jié)果
　　 HRM技術(shù)結(jié)合DNA測序結(jié)果顯示,26例PKU患者檢測到43個(gè)突變(共20種不同突變位點(diǎn)),檢出率達(dá)82.69%(43/52),其中c.584_585insA和IVS10+1G＞T突變在國內(nèi)外未見報(bào)道,此外,R243Q(25%)突變?yōu)橹袊鳳KU患

9、者最常見的突變位點(diǎn)。
　　 2、MLPA檢測分析結(jié)果
　　 對(duì)于9例經(jīng)HRM檢測未發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變的患者,采用MLPA分析篩查片段的缺失與重復(fù),結(jié)果顯示1例患者PAH基因第4外顯子拷貝數(shù)增加。
　　 3、PCR-RFLP檢測分析結(jié)果
　　 PCR-RFLP方法檢測了數(shù)據(jù)庫未報(bào)道的兩個(gè)突變位點(diǎn),結(jié)果顯示:c.584_585insA和IVS10+1G＞T突變位點(diǎn)在73名無關(guān)正常個(gè)體中未檢測到多態(tài)性等位片段。

10、>　　 結(jié)論:
　　 26例PKU患者PAH基因突變篩查中,聯(lián)合應(yīng)用HRM、MLPA和DNA測序技術(shù)檢測到44個(gè)突變(共21種不同突變位點(diǎn)),包括第4外顯子拷貝數(shù)的增加,總檢出率達(dá)84.62%(44/52),其中c.584_585insA和IVS10+1G＞T突變在國內(nèi)外未見報(bào)道。
　　 運(yùn)用HRM、MLPA和DNA測序技術(shù)相對(duì)提高了PAH基因突變篩查的檢出率,檢測結(jié)果豐富了人類基因突變數(shù)據(jù)庫,并為PKU臨床診斷與產(chǎn)前

11、診斷提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　 第二部分，目的：先天并(多)指(趾)(synpolydactyly,SPD)是一種罕見的以手足畸形為主要癥狀的常染色體顯性遺傳病,除并指(趾)癥狀外,還伴有多指(趾),不同家系間以及同一家系不同患者間存在明顯的表現(xiàn)度及外顯率差異,典型表現(xiàn)為3-4并指及4-5并趾,蹼中的第4指及第5趾呈現(xiàn)部分或完全多指(趾)。該病致病基因?yàn)镠OXD13,定位于2q31.1,含有2個(gè)外顯子,基因全長為1365bp,編碼3

12、43個(gè)氨基酸,外顯子1編碼蛋白中含有一個(gè)15A1a的多聚丙氨酸鏈(PloyA),外顯子2編碼蛋白中包含一個(gè)60個(gè)氨基酸的同源盒結(jié)構(gòu)域。
　　 本室前期已經(jīng)在一個(gè)中國漢族并多指(趾)畸形家系中以HOXD13為候選基因進(jìn)行突變篩查,檢測出HOXD13基因剪接位點(diǎn)雜合突變c.781+1G＞A,該突變位點(diǎn)在人類突變數(shù)據(jù)庫及PubMed文獻(xiàn)中未見報(bào)道,我們證實(shí)了該變異為新的突變。在此基礎(chǔ)上,我們構(gòu)建了HOXD13基因表達(dá)載體,分別在mRN

13、A和蛋白水平對(duì)該突變位點(diǎn)所導(dǎo)致的基因表達(dá)改變進(jìn)行了檢測和分析。
　　 材料與方法：
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 本室收集1個(gè)中國漢族SPD家系,前期實(shí)驗(yàn)以HOXD13為候選基因進(jìn)行突變篩查,檢測出HOXD13基因剪接位點(diǎn)雜合突變c.781+1G＞A,目前人類突變數(shù)據(jù)庫及PubMed文獻(xiàn)中未見報(bào)道,PCR-RFLP分析結(jié)果顯示該家系正常個(gè)體及60例家系外無關(guān)正常個(gè)體中此位點(diǎn)該變異不存在,證實(shí)c.781+1G＞A非SN

14、P。
　　 二、方法
　　 1、野生型與突變型HOXD13基因表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 針對(duì)突變c.781+1G＞A,以p3xFLAG-HOXD13WT(含有HOXD13基因CDS區(qū)域)載體為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的引物,通過PCR、酶切回收、連接、轉(zhuǎn)染、質(zhì)粒提取等步驟構(gòu)建野生型HOXD13基因表達(dá)載體p3xFLAG-CMV-7WT與帶有突變位點(diǎn)c.781+1G＞A突變型HOXDl3基因表達(dá)載體p3xFLAG

15、-CMV-7MU,并進(jìn)行測序驗(yàn)證。
　　 2、突變型HOXD13mRNA檢測
　　 將構(gòu)建好的野生型與突變型表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞,培養(yǎng)48小時(shí)后提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增HOXD13基因,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳初步檢測,回收并進(jìn)行測序驗(yàn)證。
　　 3、突變型HOXD13蛋白檢測
　　 同上轉(zhuǎn)染后的BGC823細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后提取總蛋白,WesternBlo

16、t檢測野生型與突變型HOXDl3蛋白分子量。
　　 結(jié)果:
　　 1、野生型與突變型HOXD13基因表達(dá)載體構(gòu)建
　　 野生型p3xFLAG-CMV-7WT載體與突變型p3xFLAG-CMV-7MU載體測序結(jié)果顯示無突變,開放閱讀框架(openreadingframe,ORF)閱讀正確。
　　 2、突變型HOXD13mRNA檢測結(jié)果
　　 瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示突變型HOXD13PCR產(chǎn)物片段

17、明顯小于野生型,測序結(jié)果明確突變型HOXD13PCR片段大小為609bp,野生型HOXD13PCR片段大小為823bp,提示該家系中c.781+1G＞A突變位點(diǎn)影響了原先的剪接功能,而激活了一個(gè)隱蔽性剪接位點(diǎn)。
　　 3、突變型HOXD13蛋白檢測結(jié)果
　　 WesternBlot檢測結(jié)果顯示突變型HOXD13蛋白分子量明顯小于野生型HOXD13,野生型HOXD13蛋白分子量為36kD,根據(jù)蛋白質(zhì)分子量、氨基酸組成計(jì)算器

18、軟件(http://www.proteomies.com.cn/tools/mwcal/MyMW.asp)預(yù)算突變型HOXD13蛋白分子量為19kD。
　　 結(jié)論：
　　 我們在一個(gè)中國漢族并多指(趾)畸形家系中首次檢測出HOXD13基因c.781+1G＞A突變位點(diǎn),該突變激活一個(gè)隱蔽性剪接位點(diǎn),使得剪接后mRNA大小比正常少214bp,蛋白分子量由正常的36kD變?yōu)?9kD,形成截短蛋白,引起相應(yīng)功能的喪失,構(gòu)成該家系