1、研究背景 子宮內(nèi)膜異位癥(Endometriosis，簡稱內(nèi)異癥或EMs)是一種雌激素依賴性疾病，其真正的病因和發(fā)病機(jī)制還不明確。目前臨床上治療的主要目標(biāo)只局限于減輕疼痛，提高妊娠率以及盡可能的延遲疾病復(fù)發(fā)，尚不存在針對(duì)病因治療的藥物，疾病也無法得到根治。腹腔鏡手術(shù)治療內(nèi)異癥，是目前外科治療的方法之一，但在輕中度病變、不孕和復(fù)發(fā)患者中手術(shù)的價(jià)值還存在爭議。在內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制的研究中，目前普遍接受的觀點(diǎn)是1927年Sampson等提

2、出的“種植學(xué)說”，指出異位灶必須在新生血管的支持下才能維持內(nèi)膜的生存和發(fā)展。血管生成機(jī)制已成為內(nèi)異癥公認(rèn)的重要發(fā)病機(jī)制之一。 內(nèi)皮抑素(Endostatin)是目前已知最強(qiáng)的內(nèi)源性血管形成抑制因子，它能特異地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，這預(yù)示著其在內(nèi)異癥治療中具有的巨大潛力。 目前對(duì)于內(nèi)皮抑素用于抗腫瘤血管生成的研究備受關(guān)注，且其蛋白治療在國外已進(jìn)入到Ⅱ期臨床試驗(yàn)階段，但由于內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，半衰期短，需多次重復(fù)給藥，

3、且其生產(chǎn)工藝復(fù)雜，這些都大大限制了其應(yīng)用。如果能采取基因治療的策略，使機(jī)體本身變成一個(gè)生產(chǎn)內(nèi)皮抑素蛋白的“工廠”，就可能徹底解決上述問題。腺病毒載體的應(yīng)用為內(nèi)皮抑素實(shí)現(xiàn)基因治療提供了一個(gè)很好的途徑，被廣泛地應(yīng)用于體外基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、體內(nèi)接種疫苗和基因治療等各個(gè)領(lǐng)域。 目的 為深入研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥治療中的療效，我們擬構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑素(hEndostatin)基因的缺陷型腺病毒質(zhì)粒，利用相應(yīng)的包裝細(xì)胞系，制備具有感染

4、能力的腺病毒顆粒，去感染與血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響，驗(yàn)證并探討其功能和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究內(nèi)皮抑素在子宮內(nèi)膜異位癥動(dòng)物模型上的治療作用打下基礎(chǔ)。 方法與結(jié)果 1．用基因工程方法獲得人內(nèi)皮抑素基因，設(shè)計(jì)特定限制性酶切位點(diǎn)，將內(nèi)皮抑素基因插入缺陷型腺病毒載體中。構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)測序驗(yàn)證，所獲得目的基因序列與已發(fā)表的人內(nèi)皮抑素基因序列相比，第471位氨基酸編碼堿基由G突變?yōu)锳，但編碼的氨基酸都是精

5、氨酸，與GenBank中人內(nèi)皮抑素蛋白質(zhì)序列完全一致，屬于沉默突變型，不影響后續(xù)表達(dá)。 2．將重組腺病毒質(zhì)粒線性化后通過Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，得到包含人內(nèi)皮抑素基因的完整腺病毒顆粒，通過氯化銫密度梯度離心法加以純化后，用OD260法測定其病毒滴度為5.2×10<'9>pFU/mL。 3．利用構(gòu)建好的重組人內(nèi)皮抑素腺病毒Ad-hEndo感染ECV-304臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，western

6、blot測定hEndostatin蛋白的表達(dá)情況，流式細(xì)胞術(shù)檢測Ad-hEndo引起ECV-304細(xì)胞凋亡的情況，繪制Ad-hEndo感染后的ECV-304細(xì)胞生長曲線。與對(duì)照組相比，病毒感染48小時(shí)后檢測到明顯的hEndostatin蛋白表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)Ad-hEndo在感染3d后出現(xiàn)ECV-304細(xì)胞凋亡，細(xì)胞生長曲線監(jiān)測顯示ECV-304細(xì)胞在Ad-hEndo感染后生長受到明顯限制。 結(jié)論 通過構(gòu)建包含人內(nèi)皮抑