1、牛多殺性巴氏桿菌是一種能引起牛出血性敗血癥和牛肺炎的重要病原，給肉牛養(yǎng)殖帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。根據(jù)其莢膜抗原不同可分為A、B、D、E、F等5種血清型，其中血清B和E型主要導(dǎo)致牛出血性敗血癥，血清A和F型主要引起牛呼吸系統(tǒng)疾病，導(dǎo)致牛肺炎。近年來，隨著肉牛養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，肉牛的頻繁調(diào)運導(dǎo)致的運輸應(yīng)激致使牛多殺性巴氏桿菌病的流行呈上升趨勢。目前，我們對牛多殺性巴氏桿菌致病機(jī)制還知之甚少，同時針對這方面的研究也較少，本文擬通過研究牛多殺性巴氏

2、桿菌誘導(dǎo)細(xì)胞炎性的信號通路，探討牛多殺性巴氏桿菌的致病機(jī)制，為牛多殺性巴氏桿菌病新的控制策略及新型疫苗研發(fā)提供思路。
　　本實驗以牛多殺性巴氏桿菌A型（PmA）和B型（PmB）菌株分別感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，通過qRT-PCR、Western Blot、ELISA等技術(shù)手段研究其炎癥機(jī)制，其主要目標(biāo)為：
　?。?）在體外條件下，探究PmA和PmB是否可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎性反應(yīng)；
　?。?）Toll樣受體是否參

3、與炎癥信號通路的激活；
　?。?）NF-κB、MAPK信號通路是否參與了炎癥信號通路的調(diào)節(jié)；
　　（4）炎性小體是否參與炎癥信號通路的調(diào)節(jié)；
　　（5）細(xì)胞吞噬作用是否影響炎癥信號通路的調(diào)節(jié)。
　　具體結(jié)果如下：
　　1．PmA、PmB誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)
　　采用不同的感染復(fù)數(shù)（MOI）PmA、PmB感染小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，在0.5 h、1 h、2 h、3h收集處理后的細(xì)胞和上清，qRT

4、-PCR檢測IL-1β。Western Blot檢測IL-1β、IL-18蛋白的表達(dá)情況，ELISA檢測炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-18、TNF-α的分泌情況。結(jié)果顯示，PmA、PmB感染巨噬細(xì)胞后IL-1β mRNA表達(dá)上調(diào)，呈劑量依賴型；Western Blot檢測IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)顯著增高；ELISA檢測IL-1β、IL-18、TNF-α分泌顯著的增高；說明PmA、PmB感染巨噬細(xì)胞后炎癥信號通路的激活。
　　

5、2．TLR2、TLR4介導(dǎo)炎癥信號通路
　　為了研究Toll樣受體是否參與炎癥信號通路的激活，采用10 MOI PmA、PmB感染巨噬細(xì)胞，qRT-PCR檢測TLR1、2、3、4、5、6、7、8、9的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果顯示TLR2、TLR4 mRNA表達(dá)水平顯著增高，而TLR1、3、5、6、7、8、9并沒顯著增高，說明TLR2、TLR4參與炎癥信號通路的調(diào)節(jié)。
　　3．NF-κB、MAPK信號通路參與炎癥信號通路的調(diào)節(jié)<

6、br>　　為了研究P38、JNK、NF-κB信號通路在PmA、PmB感染小鼠巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，本實驗采用10μmol的P38、JNK、NF-κB信號通路抑制劑 SB203580、SP600125、PDTC處理巨噬細(xì)胞1 h，再進(jìn)行10 MOI PmA、PmB感染，熒光定量qRT-PCR檢測IL-1βmRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，加入P38、NF-κB信號通路抑制劑PmA感染后IL-1β顯著降低，加入JNK、P38、NF-κB信號通路抑制

7、劑PmB感染后IL-1β顯著降低，表明P38、NF-κB參與了PmA誘導(dǎo)的炎癥信號通路，JNK、P38、NF-κB參與了PmB誘導(dǎo)的炎癥信號通路。
　　4．炎性小體參與炎癥信號通路的激活
　　為了研究炎性小體在炎癥信號通路中的作用，10 MOI PmA、PmB感染巨噬細(xì)胞后，在不同的時間點熒光定量qRT-PCR檢測NLRP1、AIM2、NLRP3、NLRC4、NLRP6和炎性小體接頭蛋白ASC mRNA表達(dá)水平，同時收集細(xì)胞

8、進(jìn)行Western Blot檢測NLRP3蛋白表達(dá)情況。采用0.8μmol Caspase-1的抑制劑VX-765抑制細(xì)胞后，qRT-PCR檢測IL-1β mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，NLRP1、AIM2、NLRC4并沒有顯著的增高，NLRP3、NLRP6的表達(dá)水平顯著增高，但是開始上調(diào)的時間不一樣，表明NLRP3、NLRP6參與了PmA、PmB誘導(dǎo)的炎癥信號通路的調(diào)節(jié)，Western Blot檢測NLRP3蛋白表達(dá)與qRT-PCR結(jié)

9、果一致。ASC mRNA表達(dá)水平顯著增加和IL-1βmRNA表達(dá)趨勢相一致，且呈劑量依賴型，炎癥復(fù)合體接頭蛋白ASC的激活說明炎性小體參與了PmA、PmB誘導(dǎo)的炎癥信號通路；VX-765抑制后IL-1βmRNA被顯著的抑制，說明IL-1β的表達(dá)依賴于Caspase-1，驗證了炎性小體的激活，同時也說明IL-1β在PmA、PmB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的重要作用，可作為檢測炎癥反應(yīng)是否激活的指標(biāo)。
　　5．NF-κB、MAPK信號通路參與炎性

10、小體的調(diào)控
　　為了研究P38、JNK、NF-κB信號通路和炎性小體的關(guān)系，采用10μmol的P38、JNK、NF-κB信號通路抑制劑SB203580、SP600125、PDTC處理巨噬細(xì)胞1 h，再進(jìn)行10 MOI PmA、PmB感染，熒光定量qRT-PCR檢測NLRP3、NLRP6的表達(dá)情況，結(jié)果表明，加入P38、NF-κB信號通路抑制劑PmA感染NLRP3顯著降低，但是NLRP6顯著增加。加入JNK、P38、NF-κB信號通

11、路抑制劑PmB感染后NLRP3顯著降低，NLRP6顯著增加，推測P38、NF-κB信號通路對NLRP3是正調(diào)控，對NLRP6是負(fù)調(diào)控，而JNK對于NLRP3調(diào)控不顯著但是對于NLRP6是負(fù)調(diào)控。
　　6．細(xì)胞吞噬作用參與炎癥信號通路的激活
　　為了研究細(xì)胞吞噬作用和PmA、PmB誘導(dǎo)的炎癥信號通路的關(guān)系，實驗采用細(xì)胞松弛素D處理1h后，使細(xì)胞失去吞噬作用，10 MOI PmA、PmB感染巨噬細(xì)胞，qRT-PCR檢測IL-1β

12、、ASC、NLRP3、NLRP6 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示，IL-1β、ASC、NLRP3都有極顯著性的降低，但是NLRP6出現(xiàn)顯著上調(diào)。表明細(xì)胞吞噬作用參與了PmA、PmB誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
　　7.結(jié)論
　?。?）PmA、PmB感染小鼠巨噬細(xì)胞后激活了炎癥信號通路，TLR2、TLR4介導(dǎo)炎癥信號通路。
　?。?）P38、NF-κB信號通路參與PmA誘導(dǎo)的炎癥信號通路；JNK、P38、NF-κB信號通路參與PmB誘導(dǎo)