1、肺癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，居惡性腫瘤死因的首位，其發(fā)病率及死亡率呈逐年上升的趨勢。目前對肺癌的治療方法有手術(shù)、放療和化療等，盡管這些治療手段技術(shù)上均有了長足的進步，但是由于肺癌發(fā)生的分子機制及病理過程較為復(fù)雜，其5年生存率無明顯提高，因此亟待探索新的肺癌治療手段。光動力治療(photodynamictherapy，PDT)是一種在有氧條件下，通過一定波長的激光激發(fā)靶細胞內(nèi)光敏劑產(chǎn)生活性氧物質(zhì)(reactiveoxygenspeci

2、es，ROS)直接損傷腫瘤細胞、使微血管受損造成癌組織血流灌注減少的抗腫瘤新方法。但由于腫瘤細胞可能對其治療過程中的氧化損傷及DNA損傷均具有一定的自身修復(fù)作用，影響了PDT對腫瘤的療效。脫嘌呤/脫嘧啶核酸內(nèi)切酶(apurinicapyrimidinicendonuclease，APE1)具有DNA損傷修復(fù)和氧化還原雙功能，能通過調(diào)節(jié)生物體對氧化應(yīng)激和缺氧的適應(yīng)性，最大限度地減少細胞損傷。本研究以APE1為靶點，通過Ad5/F35-AP

3、E1siRNA重組腺病毒，研究其體內(nèi)對A549細胞感染效率和對APE1基因表達的“敲除”作用，及其體內(nèi)及體外增強肺癌PDT敏感性的作用及機制。 研究目的： 1.探討APE1在非小細胞肺癌(non-smallcelllungcarcinomas，NSCLC)中的表達特點及其與患者預(yù)后的關(guān)系，為NSCLC以APE1靶點的基因治療提供臨床理論依據(jù)； 2.探討以APE1為靶點的基因治療聯(lián)合PDT在肺癌治療中的臨床應(yīng)用前景

4、。 研究內(nèi)容和方法： 1.APE1在NSCLC組織中表達及其臨床意義：采用免疫組化方法檢測NSCLC組織APE1蛋白表達特點，分析APE1表達高低與預(yù)后的關(guān)系，為進一步以APE1為靶點的基因治療提供臨床病理基礎(chǔ)。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對A549細胞殺傷效應(yīng)的實驗研究：采用流式細胞術(shù)檢測Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對A549細胞感染效率；Westernblot檢

5、測其對A549細胞APE1基因的沉默作用；采用[γ-32P]ATP標記寡核苷酸法檢測Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對A549細胞AP內(nèi)切酶活性的抑制作用；通過MTT來檢測PDT及Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對A549細胞增殖抑制作用；流式細胞檢測細胞凋亡；彗星實驗檢測DNA損傷；Westernblot檢測APE1蛋白及VEGF蛋白的表達。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)

6、合PDT對A549細胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的實驗研究：建立肺腺癌A549細胞裸鼠移植瘤動物模型，觀察Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對肺癌生長抑制的協(xié)同作用，TUNEL法檢測腫瘤細胞細胞凋亡。 研究結(jié)果： 1.APE1在NSCLC組織表達及其臨床意義：正常肺組織及NSCLC組織均有APE1表達，但其表達的定位有所區(qū)別，正常肺組織以胞核表達為主，NSCLC組織以胞漿表達為主，兩者之間差異性顯著(P＜0.

7、01)；通過Kaplan-Meier生存分析提示：APE1高低表達組之間生存時間有顯著性差異，APE1低表達組中位生存時間為35±5.196個月，APE1高表達組中位生存期為26±0.761個月。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒對A549細胞生物效應(yīng)的實驗研究：10MOI的Ad5/F35-APE1siRNA腺病毒對A549細胞的感染效率可達98％；Ad5/F35-APE1siRNA呈劑量依賴性地抑制A549細胞

8、APE1蛋白表達，且能顯著抑制A549細胞的AP內(nèi)切酶活性。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒增強A549細胞PDT治療敏感性及機制的實驗研究：Ad5/F35-APE1siRNA聯(lián)合PDT能顯著增強A549細胞的增殖抑制作用；Ad5/F35-APE1siRNA增加PDT誘導(dǎo)的A549細胞凋亡；堿性彗星分析結(jié)果顯示Ad5/F35-APE1siRNA抑制PDT后A549癌細胞DNA修復(fù)能力；PDT可誘導(dǎo)A549細胞A

9、PE1及VEGF蛋白表達增強，但通過Ad5/F35-APE1siRNA可抑制A549細胞PDT誘導(dǎo)的APE1及VEGF蛋白的表達。 4.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒聯(lián)合PDT對A549細胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的實驗研究：體內(nèi)實驗結(jié)果顯示Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤生長較單純PDT組明顯被抑制，單純Ad5/F35-APE1siRNA組腫瘤抑制率為34.85％，單純PDT組腫瘤抑制率為52.19％，

10、Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤抑制率為93.97％。TUNEL檢測腫瘤細胞凋亡情況，顯示Ad5/F35-APE1siRNA+PDT組腫瘤細胞凋亡率為(24.68±2.47)％，顯著高于Ad5/F35-APE1siRNA感染組(6.24±1.32)％、單獨PDT組(12.12±1.76)％以及對照組(3.37±1.28)％(p＜0.01)。 結(jié)論： 1.APE1在NSCLC中有胞漿異位表達的傾向，且APE

11、1表達的高低與肺癌的預(yù)后有關(guān)。 2.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒容易感染肺腺癌A549細胞，且可特異性抑制A549細胞APE1蛋白表達，抑制A549細胞的AP內(nèi)切酶活性。 3.Ad5/F35-APE1siRNA重組腺病毒能顯著增強A549細胞PDT敏感性，主要是通過兩種機制實現(xiàn)的，一方面通過抑制A549細胞PDT后的DNA損傷修復(fù)能力；另一方面通過抑制A549細胞對PDT所致氧化損傷的修復(fù)能力。