1、本研究的主要內(nèi)容包括以下幾方面： 1．重組FNC端肝素結(jié)合域多肽昆蟲表達(dá)載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，確定纖維連接蛋白C端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHC-36)克隆位置，結(jié)合昆蟲表達(dá)pFastBacTMHTB載體的酶切特點(diǎn)，設(shè)計(jì)重組rhFNHC-36基因克隆的PCR擴(kuò)增引物和酶切位點(diǎn)。利用所設(shè)計(jì)和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHC-36基因。將rhF

2、NHC-36基因克隆至pFastBacTMHTB載體上。重組載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。正確的克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)染DHlOBacTM感受態(tài)細(xì)胞，使目的基因在DH10BacTM感受態(tài)細(xì)胞中，借助Tn7轉(zhuǎn)座子的作用，轉(zhuǎn)移至大腸桿菌一昆蟲細(xì)胞的穿梭質(zhì)粒(bacmid)上，再通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色的陽(yáng)性克隆菌斑，提取質(zhì)粒。重組穿梭質(zhì)粒(bacmid-rhFNHC-36)

3、轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，以獲取重組的桿狀病毒。將重組的桿狀病毒-rhFNHC-36再次轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞表達(dá)rhFNHC-36多肽。由鎳柱分離純化rhFNHC-36多肽，SDS-PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計(jì)算分子量和其表達(dá)量。通過斑點(diǎn)雜交和westernblot方法，檢測(cè)多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性。 2．重組FNN端肝素結(jié)合域多肽酵母表達(dá)載體的構(gòu)建及多肽的制備根據(jù)FNcDNA序列，及與FN分子結(jié)構(gòu)中的氨基酸序列進(jìn)行比

4、對(duì)，確定纖維連接蛋白N端肝素結(jié)合域多肽(rhFNHN-29)克隆位置，結(jié)合酵母表達(dá)載體的酶切特點(diǎn)，設(shè)計(jì)rhFNHN-29基因克隆的PCR擴(kuò)增引物和酶切位點(diǎn)。利用所設(shè)計(jì)和合成的PCR引物，以FNcDNA為模板，PCR合成rhFNHN-29基因。將rhFNHN-29基因克隆至pGEM-T載體上。將重組的pGEM-T-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，進(jìn)行DNA序列測(cè)定。正確的克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，

5、提取重組pGEM-T-FNHN-29質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29基因連接到pAo815SM載體中。將重組的pAo815SM-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，DNA序列測(cè)定和雙酶切鑒定，提取陽(yáng)性克隆的重組pAo815SM-FNHN-29質(zhì)粒。以雙酶切和連接的方法將rhFNHN-29基因連接到pPIC9K整合型酵母表達(dá)載體上。重組pPIC9K一FNHN-29載體轉(zhuǎn)染DH5

6、a感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行陽(yáng)性克隆的選擇，挑取陽(yáng)性克隆的單菌斑，進(jìn)行DNA序列測(cè)定和雙酶切鑒定。正確的克隆進(jìn)一步擴(kuò)增，提取重組pPIC9K-FNHN-29質(zhì)粒。用BglⅡ酶切重組pPIC9K-FNHN-29質(zhì)粒，使其線性化。將線性化的pPIC9K-FNHN-29載體轉(zhuǎn)染GS115酵母細(xì)胞，進(jìn)行篩選，挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行小規(guī)模誘導(dǎo)培養(yǎng)、鑒定rhFNHN-29多肽的表達(dá)量，挑選高水平表達(dá)的菌株進(jìn)行大規(guī)模的表達(dá)。發(fā)酵液先用80％硫酸胺沉淀，沉淀物溶解后上

7、S一100柱和SP柱純化rhFNHN-29多肽。對(duì)純化的rhFNHN-29多肽進(jìn)行SDS一PAGE分析，并經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描計(jì)算其分子量。通過斑點(diǎn)雜交和westemb10t方法，檢測(cè)多肽結(jié)合肝素能力和FN的抗原性 。3．rhFNHN-29多肽對(duì)敗血癥小鼠作用的初步研究 應(yīng)用半乳糖胺增敏內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠模型對(duì)rhFNHN-29多肽抗敗血癥作用進(jìn)行研究。按LeistM等用半乳糖胺(Galactosamine，GalN)敏

8、化內(nèi)毒素脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)建立敗血癥小鼠模型，即給每只小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300μg)。建立敗血癥模型小鼠(BABL/C)共40只，雌雄各半，隨機(jī)分二組，每組20只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。在給小鼠腹腔注射半乳糖胺(10mg)和內(nèi)毒素(300μg)前半小時(shí)，后l小時(shí)，2小時(shí)，3小時(shí)兩組小鼠分別從其尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg／kg

9、)和等體積生理鹽水。于腹腔注射藥物后6小時(shí)，眶靜脈采血250u1，枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，測(cè)定血漿TNFa水平，并觀察72小時(shí)小鼠生存率。腹腔注射藥物后72小時(shí)，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。同時(shí)取肝組織做電鏡觀察。 4．rhFNHN-29多肽對(duì)DIC大鼠作用的初步研究 應(yīng)用內(nèi)毒素誘導(dǎo)的DIC大鼠模型對(duì)rhFNHN-2

10、9多肽抗DIC作用進(jìn)行研究。按TakahashiY等用內(nèi)毒素誘導(dǎo)法建立大鼠DIC模型的方法，即每只大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(50mg／kg)麻醉，股靜脈注射LPS(50mg／kg)。共建立DIC模型SD大鼠20只，體重200一250克，雌雄各半，隨機(jī)分兩組，每組10只，一組為rhFNHN-29多肽治療組，另一組為生理鹽水對(duì)照組。治療組分別于注射LPS前半小時(shí)，注射后2小時(shí)，4小時(shí)尾靜脈注射rhFNHN-29多肽(10mg／kg)，對(duì)照組注

11、射等體積生理鹽水。于注射LPS后6小時(shí)，對(duì)側(cè)股靜脈抽血5∞u1，50μ1EDTA抗凝，用于檢測(cè)白細(xì)胞(WBC)，血紅蛋白(№)，血小板(Plat)，450μl用4.5ul3．8％的枸椽酸鈉抗凝，常規(guī)分離血漿，測(cè)定血漿TNFa水平。于股靜脈注射LPS后24小時(shí)處死大鼠，取大鼠的肝、腎、脾、肺、心、腦組織，用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，常規(guī)HE染色，做組織病理形態(tài)學(xué)觀察。 本研究取得如下結(jié)果和結(jié)論： 1．成功構(gòu)建了重

12、組rhFNHC-36昆蟲表達(dá)載體，并在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)及制備了rhFNHC-36多肽。成功構(gòu)建了重組rhFNHN-29酵母表達(dá)載體，并在酵母細(xì)胞中表達(dá)及制備了rhFNHN-29多肽。制備的rhFNHC-36矛口rhFNHN-29多肽經(jīng)SDS-PAGE電泳分離，在凝膠圖象分析系統(tǒng)中測(cè)定分子量，由昆蟲表達(dá)的多肽分子量為36.09kDa，由酵母表達(dá)的多肽分子量為28．52kDa。斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)證明兩多肽均能與肝素結(jié)合，但都不能與FN抗體結(jié)合。說明

13、所合成的多肽在體外具有結(jié)合肝素的能力而沒有FN的抗原性。同樣說明利用昆蟲和酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)FN肝素結(jié)合域多肽是可行的。 2．rhFNHN-29多肽對(duì)內(nèi)毒素?cái)⊙Y小鼠和DIC大鼠具有一定的治療作用。rhFNHN-29多肽治療小鼠敗血癥的實(shí)驗(yàn)研究中，多肽治療組的死亡率為15％，對(duì)照組的死亡率為70％。rhFNHN-29多肽能明顯降低內(nèi)毒素?cái)⊙Y的死亡率(P

14、性與嚴(yán)重壞死，而多肽治療組的肝臟組織僅見局灶性的變性與輕微壞死。兩組的腎、脾、肺、心、腦等組織未見明顯病理改變。電鏡觀察，生理鹽水對(duì)照組肝細(xì)胞胞質(zhì)松散，染色變淺，細(xì)胞器崩解，而多肽治療組小鼠輕微變性，胞質(zhì)和細(xì)胞器均未見明顯改變，出現(xiàn)糖原和脂肪顆粒，并偶見少量凋亡細(xì)胞。 ELISA法檢測(cè)小鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的TNFa水平顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P<0．01)，而用rhFNHN-29多肽治療小鼠的TNF

15、a水平顯著低于生理鹽水對(duì)照組(P＜0.O1)。 RT-PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組小鼠的TNFa、IL-1β、IL-6mRNA表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組小鼠的水平(P＜0.01)，而用rgFNHN-29多肽治療的小鼠顯著低于生理鹽水對(duì)照組小鼠的水平(P＜0.01)， 在rhFNHN-29多肽治療LPS誘導(dǎo)的DIC大鼠實(shí)驗(yàn)研究中，病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，生理鹽水

16、對(duì)照組肺組織小動(dòng)脈和毛細(xì)血管出現(xiàn)廣泛血栓，肝小靜脈和毛細(xì)血管也出現(xiàn)廣泛血栓和廣泛出血，而rhFNHN-29多肽治療組僅見較輕微血栓形成和少量的出血。生理鹽水對(duì)照組的腎、脾、心、腦組織也見血栓形成和出血，而rhFNHN-29多肽治療組的腎、脾、心、腦組織見少量血栓形成，未見明顯出血。 乩ISA法檢測(cè)大鼠血漿TNFa水平，結(jié)果顯示生理鹽水對(duì)照組的TNFa水平顯著高于正常對(duì)照組(P＜0.01)，rhFNHN-29多肽治療組顯著低于生理