1、精原干細(xì)胞(Spermatogonial stem cells，SSCs)指既能自我更新維持自身群體數(shù)量恒定，又能定向分化成生殖細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生精子的一類原始精原細(xì)胞，具有干細(xì)胞最根本的生物學(xué)性質(zhì)。目前，SSCs的研究在動物精子發(fā)生發(fā)育機理、醫(yī)學(xué)臨床的男性生殖生理和轉(zhuǎn)基因動物的制備等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為干細(xì)胞研究的熱點之 一。本試驗以小鼠精原干細(xì)胞為材料，對其冷凍保存、培養(yǎng)以及體內(nèi)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行初步研究，以期為SSC

2、s的進(jìn)一步研究和利用提供參考資料，本試驗的具體內(nèi)容如下： 1.用組合酶消化法制備6日齡小鼠的生殖細(xì)胞懸液；采用差速貼壁法結(jié)合Percoll不連續(xù)密度梯度離心法分離純化精原干細(xì)胞，接種于含10％胎牛血清的極限必需培養(yǎng)基a(minimum essential medium alpha，MEMa)中，37℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長和形態(tài)變化。結(jié)果6日齡小鼠的生精小管主要包含細(xì)胞為精原干細(xì)胞、支持細(xì)胞，精原干細(xì)胞純化

3、后純度達(dá)80％以上，精原干細(xì)胞主要分布在28％～36％的Percoll梯度中。 2.以6日齡雄性昆明小白鼠精原干細(xì)胞為材料，加入不同的冷凍液以及采用不同的降溫速率冷凍小鼠精原干細(xì)胞。以MEMa為基本培養(yǎng)基，加入10％胎牛血清和100ng/mL的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，體外培養(yǎng)復(fù)蘇后精原干細(xì)胞，WST-8比色法分析培養(yǎng)精原干細(xì)胞的增殖率，運用堿性磷酸酶細(xì)胞化學(xué)染色和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription

4、 polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)，對培養(yǎng)的精原干細(xì)胞進(jìn)行鑒定，采用睪丸網(wǎng)注射法將非程控降溫方式冷凍的小鼠精原干細(xì)胞移植到受體不育小鼠睪丸生精小管，檢測精原干細(xì)胞特性。結(jié)果顯示，冷凍液中添加10％二甲基亞砜、10％胎牛血清、0.07mol/L蔗糖時，以1℃/min程控降溫方式冷凍小鼠SSCs，細(xì)胞解凍后活率最高，達(dá)84％以上；采用非程控降溫方式凍存精原干細(xì)胞，盡管細(xì)胞解凍后活率相對于程控降溫方式略低

5、，但具有方法簡單、易于操作、無需昂貴儀器的優(yōu)點，復(fù)蘇后精原干細(xì)胞貼壁時間為8h～12h，24h可見細(xì)胞分裂，48h細(xì)胞出現(xiàn)迅速增殖，96 h可見較多含20～25細(xì)胞的細(xì)胞團，此時，精原干細(xì)胞增殖近5倍；精原干細(xì)胞移植后，在受體小鼠睪丸生精小管重新啟動精子發(fā)生。試驗結(jié)果表明，本試驗所用的冷凍條件可以使經(jīng)長期冷凍的精原干細(xì)胞保留其特性；所用培養(yǎng)條件可以使經(jīng)長期冷凍的精原干細(xì)胞短期快速增殖。 3.應(yīng)用顯微注射儀將脂質(zhì)體包裹的質(zhì)粒pEG