1、研究目的：
　　流行病學(xué)研究提示microRNA-155在外周血的表達(dá)水平與T細(xì)胞對(duì)于oxLDL的抗原反應(yīng)性存在正性相關(guān),且兩者隨著患者年齡的增大都逐漸降低。本研究旨在闡明microRNA-155抑制序列能夠影響CD4+T細(xì)胞的增殖和分化,進(jìn)而減輕共培養(yǎng)體系中內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞增殖。
　　研究方法：
　　分離臍血中的造血干細(xì)胞和幼稚CD4+T細(xì)胞。使用SCF、GM-CSF和TNF-α誘導(dǎo)造血干細(xì)胞分化為幼稚D

2、C,隨后加入oxLDL使之轉(zhuǎn)化為oxLDL特異性的成熟DC。同時(shí)利用IL-2、IL-4、IL-7使CD4+T細(xì)胞保持增殖狀態(tài),并分別使用包含有microRNA-155抑制序列的慢病毒顆粒和空載慢病毒顆粒(MOI=10)轉(zhuǎn)染之。將成熟DC輻照滅活后以1:10的比例與野生組、抑制病毒轉(zhuǎn)染組、空白病毒轉(zhuǎn)染組幼稚CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),使各組CD4+T細(xì)胞對(duì)于oxLDL產(chǎn)生特異性免疫。
　　使用oxLDL持續(xù)刺激各組CD4+T細(xì)胞3d,之后

3、利用CFSE檢測(cè)T細(xì)胞的增殖,利用流式細(xì)胞儀各組T細(xì)胞亞群的比例,利用realtime-PCR檢測(cè)IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、TGF-β、HB-EGF和bFGF等的mRNA表達(dá),并評(píng)價(jià)各組T細(xì)胞對(duì)于炎癥反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞的粘附性。
　　以transwell小室為基礎(chǔ)構(gòu)建體外血管壁模型。將與臍血來(lái)源于同一供體的臍靜脈內(nèi)皮和臍動(dòng)脈平滑肌分別接種于PET膜的兩個(gè)側(cè)面并培育7d,使兩種細(xì)胞之間通過(guò)微孔形成縫隙連接。
　　將

4、各組oxLDL特異性CD4+T細(xì)胞以10:1的比例與內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞共培養(yǎng)3d,利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞CD80、CD86、VCAM和HLA-DR的表達(dá)量,利用JC-1檢測(cè)反映內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡的線粒體膜電位,并利用EMSA檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞NK-κB通路的激活情況。在平滑肌細(xì)胞方面則進(jìn)行劃痕試驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)和EdU滲入實(shí)驗(yàn),并使用realtime-PCR檢測(cè)CNN、TAGLN和ACTA的mRNA表達(dá)量,利用EMSA檢測(cè)Wnt通路的激活

5、情況。
　　采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,使用不完全匹配的、雙尾的、學(xué)生t檢驗(yàn),P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　在oxLDL刺激3d后,轉(zhuǎn)染microRNA-155抑制序列的CD4+T細(xì)胞中Th2和Treg細(xì)胞的百分比明顯高于野生組和空白病毒轉(zhuǎn)染組(P<0.05),IL-2、TNF-α、HB-EGF和bFGF的mRNA表達(dá)量明顯低于野生組和空白病毒轉(zhuǎn)染組(P<0.05),而IL

6、-4、IL-10和TGF-β明顯高于其余兩組(P<0.05)。同時(shí)轉(zhuǎn)染microRNA-155抑制序列會(huì)明顯抑制CD4+T細(xì)胞的增殖(P<0.05),同時(shí)對(duì)于細(xì)胞粘附產(chǎn)生影響(P<0.05)。
　　將各組CD4+T細(xì)胞與以transwell小室基礎(chǔ)的體外血管壁模型共培養(yǎng),轉(zhuǎn)染抑制序列的CD4+T細(xì)胞可以明顯減輕內(nèi)皮細(xì)胞表面CD80、CD86、VCAM和HLA-DR的表達(dá)量(P<0.05)和細(xì)胞凋亡(P<0.01),同時(shí)NF-κB通

7、路的激活程度也相應(yīng)減低。平滑肌細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)等顯示轉(zhuǎn)染microRNA-155抑制序列的CD4+T細(xì)胞能夠減輕細(xì)胞增殖,同時(shí)在12h時(shí)減輕CNN、TAGLN和ACTA的mRNA表達(dá)量(P<0.02),并降低Wnt通路的激活程度。
　　研究結(jié)論：
　　減少CD4+T細(xì)胞中microRNA-155的表達(dá)會(huì)抑制T細(xì)胞的激活和增殖,并使之向Th2和Treg方向分化,進(jìn)而改變細(xì)胞因子分泌譜。CD4+T細(xì)胞的這種改變會(huì)減輕內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反