1、目的：觀察rAAV1-EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)于脂肪源間充質(zhì)干細(xì)胞(ADMSCs)生物學(xué)特性的影響；檢測(cè)rAAV1-EGFP體外轉(zhuǎn)染ADMSCs后，ADMSCs-EGFP同種異體移植能否在梗死心肌局部持續(xù)表達(dá)外源性EGFP。研究rAAV1-1HGF體外轉(zhuǎn)染對(duì)于ADMSCs分泌功能的影響；探討同種異體ADMSCs-hHGF移植治療大鼠急性心肌梗死的可行性及有效性。 方法：(1)觀察rAAV1-EGFP轉(zhuǎn)染對(duì)于ADMSCs生物學(xué)特性的影響。取

2、雄性Wister大鼠附睪處脂肪組織，消化分離法獲取ADMSCs，體外培養(yǎng)、擴(kuò)增及鑒定，rAAV1-EGPF轉(zhuǎn)染，觀察轉(zhuǎn)染后ADMSCs生長(zhǎng)特點(diǎn)、表面特異性標(biāo)記、多向分化潛能的變化情況。(2)鑒定同種異體ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持續(xù)表達(dá)外源性EGFP。將60只雄性Wister大鼠隨機(jī)平均分為陰性對(duì)照組(n=15)、細(xì)胞移植1周組(n=15)、細(xì)胞移植4周組(n=15)、細(xì)胞移植8周組(n=15)，采用結(jié)扎

3、冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，采用經(jīng)心外膜心肌直接注射的方法，于心肌梗死區(qū)及其周圍分別注射PBS(陰性對(duì)照組)和ADMSCs-EGFP(細(xì)胞移植組)，分別于術(shù)后1周末、4周末及8周末處死細(xì)胞移植組大鼠，應(yīng)用熒光顯微鏡、EGFP免疫組織化學(xué)染色和圖象分析方法檢測(cè)同種異體ADMSCs-EGFP移植能否在急性心肌梗死大鼠的心肌局部持續(xù)性表達(dá)外源性EGFP。術(shù)后8周末處死PBS組大鼠作為陰性對(duì)照。(3)構(gòu)建rAAV1-hHGF。A

4、DMSCs接種至6孔板，接種細(xì)胞隨機(jī)分為未轉(zhuǎn)染組(陰性對(duì)照組)和rAAV1-hHGF轉(zhuǎn)染組，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附方法(ELISA)測(cè)定轉(zhuǎn)染hHGF后第1～8天內(nèi)每日細(xì)胞上清液中hHGF濃度的變化情況，同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察細(xì)胞分泌能力的改變。(4)同種異體ADMSCs移植聯(lián)合轉(zhuǎn)基因hHGF治療大鼠急性心肌梗死。將100只雄性Wister大鼠隨機(jī)平均分為PBS組(n=25)，單純ADMSCs治療組(n=25)，單純hHGF治療組(n=25)，

5、ADMSCs-hHGF治療組(n=25)，采用結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支的方法制備急性心肌梗死模型，經(jīng)心外膜心肌直接注射的方法給予相應(yīng)治療。術(shù)后8周末采用導(dǎo)管法及超聲心動(dòng)檢測(cè)判定心臟功能，隨后處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，行形態(tài)學(xué)檢測(cè)并計(jì)算梗死面積(IS)、左室球形指數(shù)(S1)和擴(kuò)張指數(shù)(DI)，天狼猩紅染色測(cè)定梗死區(qū)及非梗死區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)局部血管密度及MMP-2和MMP-9表達(dá)，行組織勻漿，應(yīng)用RT-PCR法測(cè)定梗死

6、組織中hHGF的mRNA水平，應(yīng)用Western blotting法測(cè)定梗死組織中hHGF蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：(1)rAAv1-EGFP轉(zhuǎn)染后，大鼠ADMSCs可正常貼壁，生長(zhǎng)迅速，細(xì)胞倍增時(shí)間(DT)約52.5h，多次傳代后形態(tài)上無明顯改變，其細(xì)胞表面特異性標(biāo)記及多向分化潛能未受明顯影響。(2)同種異體轉(zhuǎn)基因ADMSCs-EGFP移植后，1周及4周時(shí)于梗死心臟局部均可觀察到綠色熒光及相應(yīng)部位EGFP的表達(dá)，兩者相比無顯著差異

7、，移植后8周時(shí)梗死局部綠色熒光明顯減弱，但仍可見少量EGFP表達(dá)。對(duì)照組未觀察到綠色熒光及相應(yīng)部位EGFP的表達(dá)。(3)成功構(gòu)建攜帶目的基因hHGF的rAAV1。與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組上清液中hHGF的濃度及細(xì)胞分泌hHGF的能力均顯著增加。(4)心肌梗死8周后，與PBS組相比，單純ADMSCs組和轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組射血分?jǐn)?shù)(EF)、左室搏出量(LVSV)及左室舒張末容積(LVEDV)顯著增加，+dt

8、/dpmax、+dt/dpmax/LVSP以及-dt/dpmax、-dt/dpmax/LVSP顯著升高，左室相對(duì)重量顯著增加，梗死區(qū)及邊緣區(qū)Ⅰ、Ⅲ型膠原容積分?jǐn)?shù)均顯著降低，而局部血管數(shù)目顯著增多，MMP-2、MMP-9顯著減少，但細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)沒有明顯變化。與單純ADMSCs組相比，轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hHGF組局部血管數(shù)目增加更為明顯，而MMP-9減少程度低于前者。同時(shí)，在細(xì)胞移植8周后，單純hHGF組和轉(zhuǎn)基因ADMSCs-hH