1、目的:肝纖維化(liver fibrosi s，LF)為各種慢性肝疾患所導(dǎo)致的一系列損傷一修復(fù)，最終肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)過度沉積的反應(yīng)。由于發(fā)生的機(jī)制比較復(fù)雜，至今對(duì)肝纖維化的了解還很有限，因此制約了肝纖維化治療的發(fā)展。肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate cell，HSC)作為 ECM 的主要生成細(xì)胞，被認(rèn)為是各種肝臟損傷引起肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中，對(duì)肝

2、星狀細(xì)胞激活的啟動(dòng)、維持，細(xì)胞外基質(zhì)也起著重要的作用。HSC與ECM之間存在著復(fù)雜的相互作用，而其相互作用主要經(jīng)整合素介導(dǎo)。黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)是整合素信號(hào)途徑中連接整合素與下游信號(hào)分子的媒介，是胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)途徑的交匯點(diǎn)。其中，以FAK為中心的整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要是Ras-MAPK途徑，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellularsignal-regulated kinase，ERK

3、1/2)是MAPK家族中研究最為清楚的成員，其通路Ras-RAF-MEK-ERK參與細(xì)胞多種活動(dòng)?？估w軟肝顆粒組方在臨床上有良好的療效，現(xiàn)將其制成適應(yīng)臨床需要的顆粒劑。在既往研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從肝星狀細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用著手，以整合素、FAK、ERK1/2為研究切入點(diǎn)，研究抗纖軟肝顆粒對(duì)肝星狀細(xì)胞整合素信號(hào)通路的影響，由此闡釋抗纖軟肝顆?？垢涡菭罴?xì)胞增殖與誘導(dǎo)凋亡的作用機(jī)制。 方法： (1)首先根

4、據(jù)處方中丹參、莪術(shù)及鱉甲所含化學(xué)成分的理化性質(zhì)及其藥理作用，以提取丹參酮ⅡA和莪術(shù)揮發(fā)油為目的，確定抗纖軟肝顆粒的制備制成工藝，用正交設(shè)計(jì)的直觀分析優(yōu)化幾種輔料的用量確定最終的制劑處方。 (2)考察成品的體外溶出度；同時(shí)對(duì)之進(jìn)行全面的質(zhì)量控制研究，制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 (3)運(yùn)用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，以HSC-T6細(xì)胞系為研究對(duì)象，分為空白包被+10％生理鹽水血清組、FN包被+10％生理鹽水血清組、FN包被+5％kxr組、FN包被

5、+10％kxr組、FN包被+20％kxr組。按以上分組進(jìn)行藥物干預(yù)，各組FN(3μg/ml)均于kxr加入前30分鐘加入，干預(yù)后繼續(xù)培養(yǎng)48h。 (4)采用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖，采用甲苯胺藍(lán)染色方法測(cè)定細(xì)胞黏附率；Annexin V-PE/7-ADD法測(cè)定 Hsc凋亡。 (5)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)HSC整合素α5β1蛋白的表達(dá)。 (6)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè) HSC FAK 蛋白的表達(dá)，采用RT-PC

6、R法測(cè)定FAKmRNA的表達(dá)。 (7)應(yīng)用免疫細(xì)胞組織化學(xué)方法檢測(cè)HSC ERK1蛋白的表達(dá)，采用RT-PCR法測(cè)定ERK1mRNA的表達(dá)。 結(jié)果： (1)丹參的滲漉最佳工藝為：用90％的乙醇進(jìn)行滲漉，流速為0.6ml/min，乙醇用量為12倍，浸泡時(shí)間為16h；鱉甲超微粉碎后置顯微鏡下觀察，可見粒徑小于5um的多于50％，粒徑小于10um的多于90％；莪術(shù)揮發(fā)油的最佳提取工藝為加水8倍，浸泡時(shí)間為0.5h，煎煮

7、5h。莪術(shù)揮發(fā)油的最佳包合工藝為揮發(fā)油：β-CD(1：4)，攪拌時(shí)間為60min，包合溫度為50℃，以10000r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行包合。制備工藝中確定以糊精為輔料，藥物：糊精：1：0.5，以50％乙醇為潤(rùn)濕劑，加入0.4％倍CMC作為助懸劑，過16目篩制粒，50℃干燥，10目篩整粒。 (2)含量測(cè)定方法學(xué)考察實(shí)驗(yàn)中，其回收率合格，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，說明了所制定的含量測(cè)定方法的合理性和可行性；樣品在考察期各項(xiàng)指標(biāo)無明顯

8、變化，均符合規(guī)定。 (3)與FN組比較，kxr各組均可以抑制HSC增殖，存在顯著差異(P<0.01)，kxr各組均可以誘導(dǎo)HSC凋亡，與FN組及空白對(duì)照組比較存在顯著差異(P<0.01)，與空白對(duì)照組比較，kxr 各組均可以抑制 FN與HSC的粘附，存在顯著差異(P<0.01)。 (4)抗纖軟肝顆粒含藥血清組HSC的整合素α5β1蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，與空白對(duì)照組及FN組相比有顯著性差異(P<0.01)。 (5)抗纖

9、軟肝顆粒含藥血清組HSC的FAKmRNA、蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，分別減少了 43.32％(11.93％)，56.52％(39.52％)，70.27％(53.42％)，與對(duì)照組及FN組相比，KXR1組(p<0.05)，KXR2組、KXR3組(p<0.01)，均有顯著性差異。 (6)抗纖軟肝顆粒含藥血清組HSC的ERK1mRNA、蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)，分別減少了 39.53％(8.93％)。47.45％(35.62％)，56.78％(5

10、0.12％)，與對(duì)照組及 FN組相比，KXR1組(p<0.05)，KXR2組、KXR3組(p<0.01)，均有顯著性差異。 結(jié)論： (1)所確定的制備工藝穩(wěn)定可行，質(zhì)量控制方法合理可行。 (2)FN 能夠刺激HSC增殖，由此可知細(xì)胞外基質(zhì)通過整合素介導(dǎo)對(duì)肝星狀細(xì)胞激活的啟動(dòng)、維持起著重要的作用。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抗纖軟肝顆粒含藥血清可以抑制由FN刺激的HSC增殖，并誘導(dǎo)HSC凋亡，并能抑制HSC的粘附，呈劑量依賴關(guān)系?？?/p>

11、纖軟肝顆粒能夠下調(diào)HSC整合素α5β1的表達(dá)，能夠在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平抑制FAK及ERK1mRNA、蛋白的表達(dá)。 (3)抗纖軟肝顆粒含藥血清有較好的抑制HSC增殖，并誘導(dǎo)HSC凋亡的作用，可能是通過以下途徑實(shí)現(xiàn)的：抑制或拮抗了細(xì)胞外基質(zhì)與其受體整合素的結(jié)合，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)與HSC的粘附；通過下調(diào)整合素蛋白的表達(dá)，降低下游信號(hào)分子FAK及ERK1mRNA、蛋白的表達(dá)，阻抑了整合素激活的 FAK 信號(hào)途徑中的 Ras 依賴的絲裂原活