1、目的：隨著人們物質(zhì)生活水平的提高，糖尿病(DiabetesMellitus，DM)的發(fā)病率明顯增高，嚴重影響糖尿病患者生存質(zhì)量的主要原因是各種并發(fā)癥。糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)就是糖尿病最常見和最嚴重的慢性并發(fā)癥之一，也是糖尿病致死、致殘的重要原因。脂肪異常升高并在腎臟中沉積是糖尿病腎病的主要病理因素之一。 已知，組織中脂質(zhì)的含量不僅與其合成有關(guān)，還與其分解代謝的速度有關(guān)。脂肪酸的分解代謝速度又與

2、過氧化物酶體增殖激活受體α(peroxisome prolif．erator activated receptorPPARα)的調(diào)節(jié)有關(guān)。PPARα是細胞中調(diào)節(jié)脂肪酸分解代謝的重要核轉(zhuǎn)錄因子。PPARα與其配體結(jié)合活化后，上調(diào)線粒體和過氧化物酶體兩個細胞器中與脂肪酸分解代謝有關(guān)的下游基因的表達，加速脂肪酸的分解，降低脂肪的含量。研究報道，糖尿病小鼠心肌線粒體和過氧化物酶體脂肪酸β氧化分解的限速酶，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶I(camitine p

3、almitoyltransferase I，CPT)和脂酰CoA氧化酶(acvl-CoA oxidase．AOX-1)基因的表達都被上調(diào)，胞內(nèi)脂肪酸的氧化供能增加。而Gregory等對鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導的糖尿病大鼠腎臟的研究卻發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎臟的脂肪沉積不僅與脂肪酸的合成增加有關(guān)，還與腎臟PPARα、PPAR<,β>和脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase，AOX-1)的表達及活性降低，脂肪

4、酸的分解速度減慢有關(guān)。 STZ誘導的糖尿病大鼠，因胰島素的缺乏而更多地依賴脂肪酸氧化供能。那么，是否糖尿病大鼠腎臟線粒體脂肪酸氧化的關(guān)鍵酶CPT也應像小鼠心肌一樣表達增加?過氧化物酶體中與脂肪酸氧化分解有關(guān)的基因，除了限速酶AOX-1基因外，L-雙功能蛋白(L-bifrunctionalprotein，LBP)、D-雙功能蛋白(L-bifunctional protein，DBP)的表達也被下調(diào)?未見報道。菲諾貝特類藥物是臨床用于降脂血

5、的藥物，是PPARα的激活配體。它通過激活PPARα，進而激活與線粒體和過氧化物酶體脂肪酸分解代謝有關(guān)的PPARα的下游基因，加強脂肪酸的分解來達到降血脂的目的。糖尿病狀態(tài)下，是否也可以人為地用菲諾貝特類藥物激活糖尿病大鼠腎中的PPARα，加速腎脂肪酸分解代謝相關(guān)基因的表達，改善腎功能?未見報道。 為此，本研究以STZ大鼠為實驗對象，通過腎組織形態(tài)學直接觀察和血清尿素氮、24小時尿蛋白的測定，確定糖尿病大鼠腎功能損傷的同時，用

6、RT-PCR方法，測定腎組織中PPARα、CPT、AOX-1、LBP、DBP等與脂肪酸分解代謝有關(guān)的基因表達情況；觀察PPARα人工合成的激活配體-降脂藥菲諾貝特，對上述各項指標的影響，探討糖尿病腎臟脂肪沉積的分子機制，深化對糖尿病脂代謝紊亂的認識。 方法 1 動物分組及取材選用成年200．250g雄性清潔級Wistar大鼠，隨機分為：正常對照組(CON)；正常6周對照組(C6)、正常6周對照+非諾貝特組(C6+F)、和

7、糖尿病大鼠6周組(D6)、糖尿病大鼠6周+非諾貝特組(D6+F)、糖尿病大鼠12周組(D12)。 糖尿病組：正常大鼠一次性腹腔注射2％STZ誘導糖尿病發(fā)生。D6+F組：在糖尿病大鼠模型建立后4周末用非諾貝特連續(xù)兩周灌胃(100 mg/kg/day)。動物處死前，收集24小時尿液用于蛋白總量的測定。頸動脈采空腹血，血清用于血糖、尿素氮測定。腎臟用于組織切片、RNA提取。 2 光鏡觀察組織病理變化按常規(guī)方法將腎組織用甲醛

8、固定、石蠟包埋、切片、HE染色后，光鏡觀察。另取新鮮組織冰凍切片，油紅染色，光鏡觀察。 3 血糖、尿素氮、甘油三酯的測定用Olympus Au2700型全自動生化分析儀測定血糖、尿素氮、甘油三酯。 4 用Lowry改良法測定24小時尿蛋白總量5 腎組織有關(guān)基因mRNA相對表達量的測定用Trizol法提取總RNA。以GAPDH作為內(nèi)參，用RT-PCR法測定PPARα、CPT、AOX-1、LBP、DBP mRNA的相對表

9、達量。 結(jié)果 1 大鼠一般情況及血、尿生化指標的改變糖尿病大鼠明顯消瘦，皮毛無光澤、疏松，反應遲鈍，多飲、多食、多尿，生長遲緩。兩周末血糖、尿素氮、24小時尿蛋白，明顯高于正常組(P<0.01)。 2 腎臟形態(tài)學指標變化糖尿病腎臟明顯增大，可見點狀黃褐色脂肪變性和淤血斑，包膜不完整或粘連。切面可見皮質(zhì)顏色變暗。}玎巳染色組織切片顯示，六周末糖尿病腎臟組織的遠端腎小管腫脹，細胞呈空泡樣改變，12周末腎小球的體積

10、增大。腎小球呈分葉狀，部分腎小球出現(xiàn)玻璃樣變，系膜細胞增生，系膜區(qū)增寬，近端腎小管上皮細胞腫脹，部分細胞呈氣球樣變。油紅染色顯示，六周末糖尿病腎臟組織有脂質(zhì)沉積。結(jié)果1.2.表示，STZ誘導了糖尿病發(fā)生，且并發(fā)了腎損傷。 3 mRNA表達結(jié)果 3.1不同時期，PPARα mRNA相對表達量的變化。 與正常組(0.338±0.149)相比，糖尿病第6周末(0.393±0.150)，第12周末(0.346±0.

11、098)腎組織PPARαmRNA的相對含量變化無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 3.2不同時期，CPT mRNA相對表達量的變化。 與正常組(0.315±0.113)相比，糖尿病腎組織CPT mRNA的含量在發(fā)病后第6周末(0.374±0.129)無明顯變化(P>0.05)，但第12周末時(0.447±0.097)的升高卻有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 表明：①PPARα被激活。②糖尿病第12周時線粒體脂肪酸的

12、β-氧化加強。 3.3不同時期，AOX-1mRNA的相對表達量的變化。 與正常組(1.697±0.258)相比，腎組織AOX-1 mRNA的相對量在糖尿病第6周末時(1.612±0.349)，無明顯變化(P>0.05)，但在糖尿病第12周末時(1.191±0.289)，卻明顯降低(P<0.01)。 3.4 不同時期LBP mRNA的相對表達量的變化。 與正常組(0.532±0.124)相比，腎組織LB

13、P mRNA的相對表達量在糖尿病第6周末時(0.508±0.150)，無明顯變化(P>0.05)，但在糖尿病第12周末時(0.169±0.094)，卻明顯降低(P<0.01)。 3.3和3.4的結(jié)果表明：糖尿病12周末時過氧化物酶體中涉及AOX-1、LBP的直鏈脂肪酸的氧化降低。 3.5不同時期DBP mRNA的相對表達量的變化。 與正常組(0.624±0.139)相比，腎組織的DBP mRNA的相對表達量在糖尿病第

14、6周末時(0.879±0.326)的增加無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但在糖尿病第12周末時(0.934±0.256)的增加有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 表明，過氧化物酶體中經(jīng)DBP催化的支鏈不飽和脂肪酸的p.氧化途徑活性加強。 4 菲諾貝特對腎脂肪酸分解代謝相關(guān)基因表達的影響與未服藥的正常大鼠相比(0.284±0.097)，菲諾貝特除了正常鼠腎CPT mRNA的相對量(0.642土0.222)明顯增加外(P<0.0

15、1)，對AOX-1(1.648±0.136)、LBP(0.399±0.097)、DBP(0.483±0.031)的相對表達量的影響無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。 表明：菲諾貝特激活了PPARα，使其下游基因CPT表達增加，進而增加了線粒體的脂肪酸氧化供能。 糖尿病6周末時，大鼠腎PPARα(0.447±0.143)、CPT(0.421±0.132)、AOX-1(1.598±0.348)、LBP(0.522±0.175)

16、、DBP(0.912±0.270)mRNA的相對表達量，與服用菲諾貝特的 6 周末糖尿病腎中 PPARα(0.315±0.159)、 CPT(0.596土0.143)、AOX-1(1.482±0.262)、LBP(0.614±0.192)、DBP(0.589±0.202)的相對量區(qū)別無統(tǒng)計學意義。 表明：糖尿病鼠腎中脂肪酸分解代謝的調(diào)節(jié)發(fā)生了改變，不同于正常大鼠腎。 結(jié)論 1 糖尿病大鼠腎過氧化物酶體由AOX-