1、該研究根據(jù)擬南芥DREB序列與水稻基因組序列對(duì)比后,得到5個(gè)相似序列,據(jù)此設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù),從水稻總DNA中擴(kuò)增出5個(gè)編碼AP2/EREBP蛋白的基因.對(duì)推測(cè)的氨基酸序列分析顯示,所編碼的蛋白均具備DREB轉(zhuǎn)錄因子的典型特征:N端有核定位信號(hào)區(qū),C端有酸性激活區(qū),及由58個(gè)氨基酸組成的AP2結(jié)合域中第14和19位氨基酸分別為纈氨酸(V)和谷氨酸(E).進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),CR350(OsDREB1-1)屬于DREB1(A-1亞族)轉(zhuǎn)

2、錄因子,即含本亞族特有的AP2結(jié)合域(第14至19位氨基酸為VCEVRE)、C末端有LWSY基序以及N端有保守的核定位信號(hào)區(qū)(PKRRAGRTKFKETRHP).另外4個(gè)屬于DREB4(A-4亞族)轉(zhuǎn)錄因子,即含本亞族特有的AP2結(jié)合域(第14至19位氨基酸為VSEIRE),在水稻中還未見(jiàn)報(bào)道.上述5個(gè)基因在水稻染色體中均為單拷貝存在,且CR102(OsDREB4-1)和CR223(OsDREB4-3)位于水稻第2號(hào)染色體;CR251(

3、OsDREB4-4)和CR350(OsDREB1-1)位于第4號(hào)染色體;CR103(OsDREB4-2)位于第10號(hào)染色體.利用Northern和RT-PCR檢測(cè)了所克隆基因的表達(dá)模式.OsDREB4-1、OsDREB4-4和OsDREB1-1為組成型表達(dá),不受干旱(脫水)、鹽(250mM NaCl)、低溫(4℃)和ABA(20μM)處理誘導(dǎo).OsDREB4-2和OsDREB4-3受干旱和鹽誘導(dǎo)表達(dá),但均不受低溫和ABA誘導(dǎo).組織表達(dá)特

4、異性檢測(cè)表明,OsDREB4-1在莖和穗中的轉(zhuǎn)錄水平很高,在葉中較低,在根和葉鞘中幾乎檢測(cè)不到轉(zhuǎn)錄本;OsDREB4-2在莖和葉中表達(dá)較高,在根和穗中有微弱表達(dá),在葉鞘中未檢測(cè)到其表達(dá);OsDREB4-3在根、莖和穗中表達(dá),在葉中的表達(dá)微弱,在葉鞘中不表達(dá);OsDREB4-4在各組織中的轉(zhuǎn)錄水平較均一;OsDREB1-1在葉、葉鞘和穗中的表達(dá)量相當(dāng)高,在莖中的表達(dá)量略低,在根中的表達(dá)微弱.對(duì)DREB1型轉(zhuǎn)錄因子(A-1亞族)與DRE元什

5、識(shí)別結(jié)合的特異性已有廣泛研究.但DREB4型轉(zhuǎn)錄因子(A-4亞族)與DRE元什識(shí)別結(jié)合的特異性還未見(jiàn)報(bào)道.本文選擇OsDREB4-2和OsDREB4-3作為典型的DREB4型轉(zhuǎn)錄因子,利用酵母單雜交方法,對(duì)它們識(shí)別結(jié)合DRE元件的特異性進(jìn)行了研究.為了深入了解所克隆的水稻DREB轉(zhuǎn)錄因子的生理功能及與非生物逆境應(yīng)答的關(guān)系,構(gòu)建了OsDREB4-2的植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化了擬南芥,篩選到了轉(zhuǎn)基因植株.轉(zhuǎn)基因植株純系的篩選和耐逆性鑒定正在進(jìn)行中