1、我國(guó)約有3000萬(wàn)公頃鹽堿化和次生鹽堿化土地，土地鹽漬化已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的主要限制因素之一。研究植物的耐鹽機(jī)理，篩選和培育適應(yīng)鹽土環(huán)境的耐鹽植物，對(duì)于鹽堿土地生態(tài)系統(tǒng)的改善及土地資源的可持續(xù)發(fā)展與利用具有深遠(yuǎn)的意義。
　　大豆是重要油料作物和經(jīng)濟(jì)作物，研究大豆耐鹽機(jī)理對(duì)培育耐鹽大豆品種具有重要意義。本研究以栽培大豆和濱海野生大豆為研究對(duì)象，分析鹽脅迫差異表達(dá)基因，并研究了其中3個(gè)表達(dá)差異顯著的基因bZIP110、WRKY49

2、和WRKY111的表達(dá)特征、調(diào)控機(jī)制與生理功能，試圖為大豆耐鹽性的遺傳改良提供參考依據(jù)。
　　利用數(shù)字表達(dá)譜(DGEP)對(duì)耐鹽的野生大豆品系“野大豆2號(hào)”和鹽敏感的栽培大豆品種“東農(nóng)690”進(jìn)行鹽脅迫差異表達(dá)基因分析，發(fā)現(xiàn)野生大豆中共有1327個(gè)基因發(fā)生差異表達(dá)，826個(gè)上調(diào)表達(dá)，501個(gè)下調(diào)表達(dá);栽培大豆中共有3627個(gè)基因表達(dá)發(fā)生差異表達(dá)，上調(diào)表達(dá)1709個(gè)，下調(diào)表達(dá)1918個(gè)。對(duì)幾個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果顯

3、示與DGEP數(shù)據(jù)中的表達(dá)趨勢(shì)一致。經(jīng)過(guò)篩選分析，選擇轉(zhuǎn)錄因子bZIP110、WRKY49和WRKY111作為與大豆耐鹽性相關(guān)的候選基因。利用大豆轉(zhuǎn)基因復(fù)合植株、轉(zhuǎn)基因擬南芥以及轉(zhuǎn)基因煙草鑒定候選基因耐鹽性，結(jié)果顯示bZIP110、WRKY49以及WRKY111基因均具有提高轉(zhuǎn)基因植株耐鹽能力的作用。
　　大豆轉(zhuǎn)錄因子bZIP110基因全長(zhǎng)1542bp，沒(méi)有內(nèi)含子，編碼區(qū)(CDS)長(zhǎng)507bp，編碼168個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位將該基因

4、定位于細(xì)胞核中，聚類(lèi)分析其屬于S組群。bZIP110受NaCl誘導(dǎo)，NaCl處理12h后，在栽培大豆和野生大豆中都出現(xiàn)顯著響應(yīng)。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，bZIP110在根、莖、葉中都有較高表達(dá)，只有在R4（盛莢期）葉中的表達(dá)量較低。過(guò)表達(dá)bZIP110能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗鹽脅迫能力，減少葉片內(nèi)Na+的積累，上調(diào)脅迫應(yīng)答基因MYB2、PAD3、UGT71B6、LCL1、DREB2、NHX1、SOS1和RCI3。其中RCI3比野生型上調(diào)達(dá)3

5、0倍，RCI3編碼一個(gè)過(guò)氧化物酶(POD)，可催化過(guò)氧化氫(H2O2)、酚類(lèi)和胺類(lèi)化合物分解，具有消除過(guò)氧化氫和酚類(lèi)、胺類(lèi)毒性的作用，推測(cè)這可能是bZIP110能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥耐鹽性的主要原因。轉(zhuǎn)基因擬南芥中脅迫應(yīng)答基因CCA1、LTP3和P5CS沒(méi)有顯著差異，LHY有顯著降低。酵母雙雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bZIP110具有自激活作用，并且能與C組群的bZIP105互作。酵母單雜交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)bZIP110與DNA基序ACGT有一定的結(jié)合作用，但沒(méi)

6、有bZIP105與之的結(jié)合作用強(qiáng)。綜合酵母單雜交和雙雜交結(jié)果，可以推斷bZIP110與bZIP105相互作用形成異源復(fù)合二聚體后，bZIP105綁定DNA序列，而bZIP110行使激活下游基因的作用。
　　大豆轉(zhuǎn)錄因子WRKY49基因全長(zhǎng)3519bp，有4個(gè)內(nèi)含子，CDS長(zhǎng)1728bp，編碼575個(gè)氨基酸，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示其定位于細(xì)胞核中，具有兩個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域和一個(gè)“鋅指基序”，聚類(lèi)分析顯示屬于Ⅰ組群。WRKY49被鹽脅迫強(qiáng)烈

7、誘導(dǎo)。200mMNaCl處理后，WRKY49在栽培大豆中響應(yīng)速度快，但是在野生大豆中表達(dá)更穩(wěn)定。這可能與野生大豆更耐鹽有一定關(guān)系。組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，WRKY49在所有組織中都有表達(dá)，在根和葉中表達(dá)量高，在豆莢中的表達(dá)量低。擬南芥突變體證明其功能缺失后，鹽脅迫條件下種子發(fā)芽率比野生型低;幼苗根長(zhǎng)也顯著比野生型短。過(guò)表達(dá)WRKY49能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株的耐鹽性，上調(diào)表達(dá)LHY、UGT71B6、DREB2、PAD3、RCI3、LTP3

8、、NHX1和SOS1等8個(gè)基因，其中RCI3上調(diào)表達(dá)60倍以上。CCA1、MYB2、LCL1和P5CS等4個(gè)基因的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。但轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中Na+含量與野生型無(wú)顯著差異，WRKY49可能提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥Na+區(qū)隔化的能力。
　　大豆轉(zhuǎn)錄因子WRKY111基因全長(zhǎng)3618bp，3個(gè)內(nèi)含子，CDS長(zhǎng)1197bp，編碼398個(gè)氨基酸，具有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于Ⅱc組群。WRKY111受鹽脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。鹽脅迫后WRKY

9、111在栽培大豆中響應(yīng)速度快，而在野生大豆中表達(dá)逐步上調(diào)，相對(duì)栽培大豆中更穩(wěn)定，這可能跟野生大豆更耐鹽有一定的關(guān)系。主要在根中表達(dá)，在莖、葉和花中表達(dá)量低，而在莢中基本不表達(dá)。過(guò)表達(dá)WRKY111能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株的耐鹽性，上調(diào)表達(dá)DREB2、MYB2、PAD3、RCI3、LTP3、NHX1和SOS1等7個(gè)基因，其中編碼POD基因RCI3比野生型高100倍，CCA1、LCL1、UGT71B6和P5CS等4個(gè)基因沒(méi)有明顯變化，L