1、草莓鑲脈病毒(Strawberryveinbandingvirus,SVBV)屬于花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)花椰菜花葉病毒屬(Caulimovirus),SVBV為環(huán)狀雙鏈DNA病毒,基因組結構與花椰菜花葉病毒(CaMV)相似,包含7個ORF,也含有2個啟動子。SVBV全長啟動子P1位于ORFVI基因下游,與CaMV35S啟動子的位置相同,驅動ORFI、ORFII、ORFIII、ORFIV和ORFV基因的轉錄;OR

2、FVI基因的轉錄由一個獨立的啟動子sP驅動,類似于CaMV的19S啟動子。本研究進一步分析了SVBV2個啟動子的驅動活性、驅動外源基因在植物中的表達模式以及驅動外源基因表達的穩(wěn)定性。另外,本研究還分析了SVBVORFI、ORFII、ORFIII、ORFIV和ORFV基因編碼的蛋白對全長啟動子P1的調節(jié)作用。
　　1.SVBV各啟動子驅動gus基因瞬間表達的組織化學染色
　　將pINTP1、pINTP2、pINTP3、pINT

3、P4、pINTP5和pINT121各表達載體電擊轉化的農桿菌分別注射本氏煙莖桿,組織化學染色并制備石蠟切片。顯微觀察發(fā)現(xiàn),維管組織和部分皮層組織均能觀察到藍色位點,說明各啟動子均能驅動gus基因在植物細胞中表達。
　　2.SVBV各啟動子驅動gfp基因的瞬間表達和熒光活性觀察
　　將SVBVP1、SVBVP2、SVBVP3、SVBVP4和SVBVP5各啟動子分別與載體pCHF3gfp基因前的35S啟動子置換,獲得植物表達載體

4、pCHFP1、pCHFP2、pCHFP3、pCHFP4和pCHFP5,電擊轉化農桿菌,菌液分別注射本氏煙莖桿,制備莖桿注射區(qū)徒手切片。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),各植株維管組織均能觀察到綠色熒光,說明各啟動子均能驅動gfp基因在植物細胞中表達。從各切片的綠色熒光強度上來看,pCHFP1中gfp基因的表達水平要高于陽性對照pCHF3。注射未轉化載體的農桿菌菌液,莖桿切片中幾乎觀察不到綠色熒光。
　　3.轉基因普通煙gus基因mRNA的Rea

5、l-timePCR檢測
　　Real-timePCR檢測pINTP1和pINT121轉基因普通煙gus基因的mRNA積累量,結果表明,pINTP1和pINT121轉基因普通煙gus基因的mRNA積累量均顯著高于非轉基因普通煙,pINTP1轉基因普通煙gus基因的mRNA積累量顯著高于pINT121轉基因普通煙,說明SVBVP1啟動子的驅動活性很高,且超出35S啟動子的驅動活性。
　　4.SVBV各ORF表達載體的構建及其對全

6、長啟動子P1調節(jié)作用
　　構建SVBV中國分離物各ORF植物表達載體pBIN-ORFI、pBIN-ORFII、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFIV、pBIN-ORFV和pBIN-ORFVI,電擊轉化農桿菌,將含有各表達載體的農桿菌分別和含有表達載體pINTP1的農桿菌等量混合,瞬間浸潤本氏煙葉片,熒光光度法定量分析gus表達活性,結果顯示pBIN-ORFII和pBIN-ORFV分別與pINTP1共浸潤時gus蛋白酶活性均顯

7、著高于pINTP1單獨浸潤,pBIN-ORFIV與pINTP1共浸潤時gus蛋白酶活性顯著低于pINTP1單獨浸潤,pBIN-ORFI、pBIN-ORFIII、pBIN-ORFVI分別與pINTP1共浸潤時gus蛋白酶活性與pINTP1單獨浸潤均無顯著差異。結果表明,ORFII和ORFORFV編碼蛋白均能提高P1啟動子的驅動活性,ORFI、ORFIII、ORFVI編碼蛋白對P1啟動子驅動活性沒有影響,ORFIV編碼蛋白降低P1啟動子的驅