1、乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種天然活性鐵離子結合糖蛋白，廣泛存在于動物的乳汁（初乳）、血液、唾液、小腸液等外分泌液或血漿、中性粒細胞中。乳鐵蛋白具有抗微生物、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。LF對細菌生長的抑制作用被認為是清除介質(zhì)中的鐵，由于細菌需要鐵離子以維持生長，因此乳鐵蛋白在結合鐵離子的同時起到了抑制需鐵細菌的生長，進而導致病原菌死亡。
　　 本研究將乳鐵蛋白N端基因在大腸桿菌中進行了表達，表達產(chǎn)物主要以包涵體

2、的形式存在，通過對包涵體的提取、純化、尿素梯度透析復性和復性條件的摸索，選擇最佳復性條件進行蛋白復性，將復性后的蛋白進行了細菌抑菌活性檢測，表明表達的豬乳鐵蛋白具有明顯的抑菌作用。主要結果如下：
　　 通過RT-PCR方法從泌乳三天的長白豬乳腺組織中擴增獲得了天然豬乳鐵蛋白N端基因，序列測定結果顯示基因全長為1077bp，與GenBank上發(fā)表的AY306198.1、M81327.1、L77887.1、M92089.1四株豬乳鐵

3、蛋白核苷酸序列的同源性約達99％以上。將PLF-N基因定向插入到原核表達載體pET-30b中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，在大腸桿菌中進行了誘導表達，獲得了約42KDa的目的蛋白，蛋白表達量占全菌體蛋白的10％，表明表達有待提高。
　　 為了提高PLF-N基因的表達量，以天然PLF-N基因為模板，通過密碼子優(yōu)化全基因合成了豬乳鐵蛋白N端基因，優(yōu)化后的基因命名為PLF-NS，并以相同的條件重新在大腸桿菌中進行誘導表達，優(yōu)化后的PLF-N

4、S基因得到了高效表達，并對表達條件進行優(yōu)化，表明在28℃，經(jīng)0.4mmol/LIPTG誘導3小時表達量最大，占菌體總蛋白的32％；通過Western-blot進一步分析表明豬乳鐵蛋白得到了正確表達，其產(chǎn)物分子量約為42 kDa，表達產(chǎn)物以包涵體形式存在。包涵體經(jīng)提取和純化后，純度達到98％以上。將純化后的重組蛋白進行透析復性，進行了不同復性條件的摸索，結果表明采用TE緩沖液體系，在4℃條件下，pn值為9.0，蛋白濃度為0.05mg/mL

5、，β-巰基乙醇濃度為35mmol/L，復性液中尿素梯度變化為6M、4M、2M、1.5M、1M、0.5M、0M時，蛋白的復性率最高，回收率可以達到40％。
　　 體外抑菌試驗結果表明得到的重組豬乳鐵蛋白N端有明顯的抑菌活性，通過抑菌圈法測量其活性表明重組蛋白對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、李氏桿菌、枯草芽孢桿菌、豬鏈球菌、革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌和巴氏桿菌均有抑菌活性，但對革蘭氏陽性菌的抑菌活性強于對革蘭氏陰性菌的抑菌活性