1、干旱、高溫、低溫和高鹽是嚴(yán)重影響作物生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量的環(huán)境脅迫因子。逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)順式元件及其它相關(guān)蛋白之間的相互作用，可激活或抑制下游一系列抗逆功能基因的轉(zhuǎn)錄，從而提高植物的綜合抗逆性，這在抗逆轉(zhuǎn)基因育種中具有重要研究?jī)r(jià)值。植物中AP2家族的DREB類轉(zhuǎn)錄因子是近年來(lái)抗逆分子育種研究的熱點(diǎn)，該類基因?qū)μ岣咧参锏木C合抗逆性具有重要科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。
　　菊苣是我國(guó)重要的藥食兩用植物，是菊糖的主要來(lái)源。近幾年已逐步取得了一些可

2、喜進(jìn)展，但對(duì)其基因研究進(jìn)展仍然比較緩慢。利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)進(jìn)行菊苣的品種改良是當(dāng)前菊苣育種的一個(gè)新方向，它可以打破生殖隔離，使得不同物種間遺傳交流成為可能，為拓寬植物可利用基因庫(kù)創(chuàng)造條件，彌補(bǔ)了常規(guī)雜交育種的不足，加速了作物遺傳育種的發(fā)展。
　　本研究以將軍菊苣為為材料，從菊苣中分離克隆了三條DREB類轉(zhuǎn)錄基因，并對(duì)其進(jìn)行功能分析，同時(shí)建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將軍菊苣遺傳轉(zhuǎn)化體系，為利用基因工程的方法改良菊苣的抗逆性提供基礎(chǔ)。主要結(jié)果如

3、下:
　　1.利用其他物種已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)功能的DREB類轉(zhuǎn)錄因子CDS序列，以及菊苣現(xiàn)有的EST數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)電子克隆、RACE等技術(shù)手段克隆獲得三條DREB類基因。序列分析表明這三個(gè)基因具有DREB轉(zhuǎn)錄因子所特有的功能結(jié)構(gòu)域。序列比對(duì)表明三個(gè)基因和其他已知的DREB基因除了在保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域處具有很高的同源性外，在其它區(qū)域的序列同源性不高。對(duì)將軍菊苣材料進(jìn)行各種脅迫處理(干旱、高鹽、低溫和ABA)，運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)

4、對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行基因表達(dá)特性分析。結(jié)果表明，這三個(gè)CiDREB基因在菊苣植株對(duì)干旱、高鹽、高溫、低溫和ABA的應(yīng)答反應(yīng)中起重要作用。CiDREB2不受干旱脅迫，主要對(duì)高溫脅迫產(chǎn)生響應(yīng)，ABA、低溫、高鹽也能誘導(dǎo)其表達(dá)量上升;CiDREB5受高溫、低溫和干旱誘導(dǎo)，而不受高鹽的誘導(dǎo)，且參與不依賴ABA的調(diào)控途徑;CiDREB6主要受高溫和干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)，不受低溫和高鹽誘導(dǎo)，并且該基因在葉中的表達(dá)量比根中，且受高鹽和干旱強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

5、　　2.利用酵母單雜交的方法，將CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6基因cDNA的編碼區(qū)插入到酵母表達(dá)載體pGART7-AD中，將其分別轉(zhuǎn)化到含有不同DRE元件報(bào)告質(zhì)粒的酵母菌株中，觀測(cè)轉(zhuǎn)化的重組酵母菌株在SD/-Leu/-Trp/-His+40mM3-AT選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6都具有特異結(jié)合DRE元件的活性，并且DRE核心序列兩端序列對(duì)其識(shí)別特異性有影響。把目的基

6、因插入到35S啟動(dòng)子和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因之間，構(gòu)建CiDREB轉(zhuǎn)錄因子的亞細(xì)胞定位重組載體。通過(guò)基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)12h后共聚焦顯微鏡下觀察，驗(yàn)證CiDREB是否具有核定位功能。研究結(jié)果表明，CiDREB2、CiDREB5、CiDREB6蛋白都可以在細(xì)胞核內(nèi)產(chǎn)生EGFP的綠色熒光，說(shuō)明這三個(gè)基因?qū)儆谵D(zhuǎn)錄因子類基因，能夠入核行使功能。
　　3.以將軍菊苣子葉為材料，通過(guò)植物組織培養(yǎng)的方法，探討了不同激素

7、濃度配比對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、芽分化以及根再生的影響，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將編碼獐茅液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(AINHX)導(dǎo)入將軍菊苣中，建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的將軍遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明:將軍菊苣愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化最佳培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA;最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/LNAA。獲得的抗性芽經(jīng)PCR檢測(cè)，初步證實(shí)AINHX已插入到菊苣基因組中，統(tǒng)計(jì)得將軍菊苣轉(zhuǎn)化效率為13.3％。