1、蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)為革蘭氏陽性細菌，在土壤中廣泛存在。與其它芽胞桿菌不同的是其在生長過程中會伴隨芽胞的形成而產(chǎn)生具有特異毒性的殺蟲晶體蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)對有害生物具有毒殺作用的蘇云金芽胞桿菌就有上千種。
　　 根據(jù)不同生長時期蘇云金芽胞桿菌YBT-1520比較蛋白質(zhì)組研究，在蘇云金芽胞桿菌穩(wěn)定期后期有一種絲氨酸蛋白激酶(PrkA)大量表達，并且表現(xiàn)出明顯的磷酸化圖譜，而蘇云金芽胞桿菌的芽

2、胞和伴胞晶體也是在穩(wěn)定期中后期才形成的，因此推斷PrkA蛋白與蘇云金芽胞桿菌芽胞和伴胞晶體合成有密切關系。PrkA蛋白最早在枯草芽胞桿菌中分離得到，只檢測到絲氨酸蛋白磷酸化活性，其生物學功能尚未明了，因此通過對PrkA蛋白進行功能驗證，期望揭示PrkA在蘇云金芽胞桿菌的代謝活動中所參與的調(diào)控作用，同時揭示PrkA對蘇云金芽胞桿菌芽胞的形成及殺蟲晶體蛋白表達之間的關系，以求對伴胞晶體的形成機制有更加深入的了解。
　　 1.本課題是

3、對PrkA蛋白進行功能驗證，首先通過PrkA過表達實驗對過表達菌株和野生株進行生理特性比較，發(fā)現(xiàn)PrkA過表達菌株較野生株其菌液不易出現(xiàn)沉降現(xiàn)象，且其芽胞和伴胞晶體的形成時間提前。
　　 2.PrkA的motif搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)其含有Sigma-54 interaction domain，因而需要對PrkA與Sigma54進行互作驗證，驗證通過GST pull-down技術和細菌雙雜交技術完成，經(jīng)驗證PrkA與Sigma54之間無相

4、互作用。
　　 3.為了尋找與PrkA互作的蛋白，首先將prkA目的基因插入表達載體pGEX構(gòu)建原核表達載體質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21表達純化GST-PrkA融合蛋白;然后通過GST pull-down技術和雙向電泳實驗尋找可能與PrkA存在相互作用的蛋白，對特異蛋白條帶進行質(zhì)譜鑒定;最后，對質(zhì)譜鑒定得到的九種蛋白進行功能分析，猜測菌液沉降實驗與PrkA對GGDEF family protein的調(diào)節(jié)有關，而芽胞和伴胞