1、結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的一種慢性傳染病，已困擾人類數(shù)千年。盡管目前的正規(guī)聯(lián)合治療方案 (DOTS)取得良好的效果，但與其他感染性疾病相比，該病的治療存在病程遷延、易復(fù)發(fā)的問(wèn)題。資料表明全球大約有1/3的人口具有結(jié)核分枝桿菌的潛伏感染，隨著社會(huì)老齡化、HIV感染和耐藥菌株的流行，這一問(wèn)題日漸突出，成為人類防治結(jié)核病的重要“瓶頸問(wèn)題”。結(jié)核分枝桿菌的持留狀態(tài)或稱持留菌(My

2、cobacterial tuberculosis persister)被認(rèn)為是結(jié)核病病程遷延、復(fù)發(fā)的根本原因。因此，探索MTB長(zhǎng)期持留的分子機(jī)制，尋找抗結(jié)核潛伏感染的有效途徑將為人類戰(zhàn)勝結(jié)核病帶來(lái)新的希望。 目前關(guān)于結(jié)核分枝桿菌持留狀態(tài)的分子生物學(xué)機(jī)制眾說(shuō)紛紜。近年在原核生物染色體基因組上廣泛存在被認(rèn)為參與原核生物基因表達(dá)質(zhì)量控制的 TA 系統(tǒng) (Toxin-antitoxin model)可能與細(xì)菌在壓力因素下的長(zhǎng)期存活密切相

3、關(guān)。Gerdes等通過(guò)比較基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)在結(jié)核桿菌 H37Rv株中含有38個(gè)TA loci，其中包括3個(gè)relBE位點(diǎn)。但關(guān)于這些基因在結(jié)核分枝桿菌中的生物學(xué)意義國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。因此對(duì)這些未知功能的假想蛋白基因進(jìn)行研究不僅對(duì)結(jié)核分枝桿菌后基因組學(xué)的研究增添實(shí)驗(yàn)資料，而且可能對(duì)深入認(rèn)識(shí)、理解結(jié)核桿菌持留狀態(tài)的分子生物機(jī)制提供新的研究方向。 本研究在文獻(xiàn)資料和生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上以結(jié)核桿菌H37Rv株基因組DNA為模板，首次對(duì)結(jié)

4、核分枝桿菌Rvl246c和Rvl247c基因進(jìn)行克隆和融合表達(dá)，并構(gòu)建了pMV-relBE(含Rvl246c-Rvl247c重疊基因)大腸桿菌一分枝桿菌重組表達(dá)穿梭質(zhì)粒，用電穿孔方法將該質(zhì)粒導(dǎo)入快速生長(zhǎng)型非致病性恥垢分枝桿菌mc<'2>155株，并對(duì)該重組菌在體外壓力環(huán)境和巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活情況及對(duì)巨噬細(xì)胞功能影響進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，初步探索目的基因在菌體存活、繁殖速率以及抵抗體內(nèi)外環(huán)境壓力等方面的功能；同時(shí)利用酵母雙雜交系統(tǒng)，在酵母細(xì)胞體內(nèi)觀

5、察 RVl246c-Rvl247c 基因編碼假想蛋白間的相互作用，為研究該對(duì)基因是否具有TA系統(tǒng)抗毒素一毒素通用模式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 以重組恥垢分枝桿菌MCBE(負(fù)載Rvl246c-R-V1247c重疊基因)和 MC261 (負(fù)載pMV261空質(zhì)粒)為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在體外營(yíng)養(yǎng)豐富，培養(yǎng)條件適宜的環(huán)境下監(jiān)測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)曲線，表明二者增殖特性相似，外源基因在該條件下不影響正常恥垢分枝桿菌的生長(zhǎng)。在與上述相同培養(yǎng)條件下分別施加不同時(shí)間的熱壓力

6、(53℃)和酸壓力(pH 4．0)，通過(guò)對(duì)不同壓力時(shí)間處理后細(xì)菌CFU (克隆形成單位)變化的統(tǒng)計(jì)分析，推測(cè)結(jié)核 RVl246c-Rvl247c基因具有在體外壓力環(huán)境中使菌體增殖延緩、通過(guò)調(diào)整菌體生長(zhǎng)代謝狀態(tài)以對(duì)抗環(huán)境壓力的分子功能。感染小鼠ANA-1巨噬細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)表明：與對(duì)照組相比較，負(fù)載Rvl246c-Rvl247c重疊基因的重組恥垢分枝桿菌MCBE．感染巨噬細(xì)胞后其胞內(nèi)繁殖速度較緩慢，且表現(xiàn)為觸發(fā)感染細(xì)胞凋亡的能力較弱及刺激細(xì)胞明

7、顯活化反應(yīng)相對(duì)遲緩的現(xiàn)象。酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)表明結(jié)核Rvl246c和Rvl247c基因編碼的假想蛋白在酵母細(xì)胞內(nèi)可以相互作用，推測(cè)二者具有TA系統(tǒng)抗毒素一毒素蛋白共同的胞內(nèi)天然復(fù)合體形式。 綜上所述，本研究從生物信息學(xué)角度推測(cè)結(jié)核分枝桿菌Rvl246c和 Rvl247c基因編碼的假想蛋白屬于原核生物TA系統(tǒng)relBE家族；構(gòu)建能夠表達(dá)Rvl246c和Rvl247c基因編碼假想保守蛋白的重組恥垢分枝桿菌能較對(duì)照組更易對(duì)抗體內(nèi)外壓力及抵