1、疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一種廣泛分布的嗜熱真菌，是真核生物中生長(zhǎng)上限溫度最高的一種真菌，從該菌中已分離了多種嗜熱酶，并進(jìn)行了真核表達(dá)，使得該菌種在工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和微生物研究中的作用越來(lái)越大。目前，對(duì)該嗜熱菌感受和傳導(dǎo)信號(hào)的機(jī)制尚不清楚。通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化，向菌株基因組隨機(jī)插入外源質(zhì)粒DNA，構(gòu)建該菌的突變體，對(duì)探索該菌的嗜熱性機(jī)制具有重要意義。此外，遺傳轉(zhuǎn)化體系的構(gòu)建為研究基因的功能，分離功能基因提供

2、了重要的手段，也為外源基因在其體內(nèi)的表達(dá)提供了有效地途徑。
　　 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化因其優(yōu)點(diǎn)眾多而得到廣泛的利用，而此方法尚未在嗜熱真菌的轉(zhuǎn)化中獲得成功。本文以嗜熱真菌T.lanuginosus為研究對(duì)象，首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法建立了其遺傳轉(zhuǎn)化體系，并對(duì)該體系的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化，包括農(nóng)桿菌菌株，孢子萌發(fā)時(shí)間，孢子濃度及乙酰丁香酮的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化效率的影響。最終確定農(nóng)桿菌菌株EHA105在孢子萌發(fā)4h，孢子濃度為5×106個(gè)/皿，共

3、培養(yǎng)時(shí)AS濃度為500μM時(shí)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到最高。隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果證明潮霉素基因已經(jīng)整合到受體菌的基因組中；連續(xù)轉(zhuǎn)接5代，大部分轉(zhuǎn)化子能夠穩(wěn)定遺傳。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了Southern雜交驗(yàn)證，單拷貝插入率較高，達(dá)到了83.3％；分離T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列，經(jīng)分析得出T-DNA的插入位點(diǎn)是隨機(jī)的，證明該體系是一個(gè)高效獲得插入突變體的體系。此外，通過(guò)電擊的方法轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pUCATPH轉(zhuǎn)化T.lanuginosus的原生質(zhì)體

4、，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗(yàn)證潮霉素基因已經(jīng)整合到受體菌的基因組中。
　　 蛋白激酶基因pspk是我們從疏綿狀嗜熱絲孢菌中分離到的1種新的蛋白激酶基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析推測(cè)其可能具有mRNA裁剪的功能，其具體的功能尚需進(jìn)行研究分析。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位信息對(duì)于了解其功能有重要的意義，為分析T.lanuginosus蛋白激酶基因pspk的功能，構(gòu)建了該基因與GFP基因的融合表達(dá)載體pROKⅡ－GFP-pspk，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)化洋

5、蔥表皮細(xì)胞并在其中進(jìn)行表達(dá)，在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察，綠色熒光出現(xiàn)在細(xì)胞核的位置，推測(cè)該蛋白激酶在洋蔥表皮亞細(xì)胞定位的部位為細(xì)胞核。為進(jìn)一步分析該基因的功能，依據(jù)同源重組原理構(gòu)建了敲除該基因的打靶載體pUCATPH/PK和pROKⅡ－h(huán)ygro/PK，分別用于電擊轉(zhuǎn)化和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法敲除該基因，上下游同源臂分別為739bp和737bp，為今后進(jìn)行嗜熱真菌T.lanuginosus中蛋白激酶基因pspk的敲除，獲得pspk基因缺失的突