1、研究背景:
　　脂肪間充質干細胞是一種在脂肪組織中分離出來的多能干細胞，在特定的誘導條件下，可以向脂肪、骨、軟骨等細胞類型分化。由于脂肪間充質干細胞成軟骨分化能力的證實，其作為軟骨工程種子細胞的研究越來越多。實驗證實，脂肪間充質干細胞在三維培養(yǎng)環(huán)境中高密度培養(yǎng)可以成軟骨誘導，但在單層培養(yǎng)誘導時無軟骨細胞生成，其中三維培養(yǎng)方法有微滴法，微團法。有文獻報道，成體軟骨細胞單層高密度培養(yǎng)可以形成軟骨細胞膜片樣結構，在此基礎上，設想利用脂肪

2、間充質干細胞成軟骨細胞誘導后的細胞，再做單層高密度培養(yǎng)，觀察形成軟骨膜片的可行性，并進一步觀察形成質韌軟骨組織的可行性。探索脂肪間充質干細胞成軟骨誘導的新方法。
　　實驗目的:
　　將大鼠脂肪間充質干細胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)在藻酸鹽凝膠中高密度培養(yǎng)成軟骨細胞誘導后，將細胞自凝膠中釋放單層高密度培養(yǎng)，探索脂肪間充質干細胞成軟骨細胞誘導后的細胞形成軟骨組織的可行性。
　　實驗方法

3、:
　　取健康SD大鼠雙側腹股溝脂肪組織，用0.1％Ⅰ型膠原酶將脂肪組織消化為單細胞懸液后離心，得到脂肪間充質干細胞原代培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)。細胞增殖達到融合時，用0.25％胰蛋白酶消化傳代后用流式細胞技術檢測間充質干細胞表面標志CD90、CD44的表達進行細胞鑒定。
　　將第6代脂肪間充質干細胞以5×106/ml密度重懸于藻酸鈣凝膠中，形成脂肪間充質干細胞-藻酸鹽微珠，用含有軟骨誘導細胞因子TGF-β1(transformi

4、nggrowthfactor-β1)、胰島素轉鐵蛋白硒(Insulin-Transferrin-Selenium，ITS)、維生素C的成軟骨誘導培養(yǎng)基成軟骨細胞誘導培養(yǎng)2周。2周后將凝膠吹散釋放出成軟骨誘導后的細胞，將得到的細胞進行免疫組化實驗，檢測大鼠軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白的表達，以鑒定軟骨組織的生成。
　　將成軟骨誘導后的細胞單層高密度培養(yǎng)于培養(yǎng)皿中，繼續(xù)以軟骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)2周，觀察細胞的生長特點及是否有新生組織形成。探

5、索脂肪間充質干細胞在藻酸鈣中成軟骨誘導后，單層高密度培養(yǎng)形成軟骨組織的可行性。
　　實驗結果:
　　大鼠脂肪間充質干細胞原代及傳代后呈梭形生長，傳代后的細胞呈規(guī)則排列漩渦狀生長。第6代次細胞形態(tài)仍無明顯改變，細胞傳代后細胞特性保持較為穩(wěn)定。大鼠脂肪間充質干細胞的表面標志CD90、CD44陽性，說明其為間充質干細胞來源。脂肪間充質干細胞-藻酸鹽微珠成軟骨誘導2周后，釋放出的細胞行細胞免疫組織化學檢測軟骨特異性Ⅱ型膠原蛋白的表達