1、昆蟲抗菌肽是昆蟲對入侵病原微生物免疫應答反映的效應物，當受到微生物侵染時，其脂肪體和血細胞等中會產(chǎn)生一類小分子物質，并迅速釋放到血淋巴中抵抗微生物入侵。它們大多是陽離子肽，分子量小，有廣泛的殺菌譜，對細菌等病原菌、甚至腫瘤細胞和病毒也有抑殺作用，有望發(fā)展成為新一代肽類抗生素。目前，在鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目、膜翅目和等翅目中發(fā)現(xiàn)200多種昆蟲抗菌肽，而金小蜂體內(nèi)抗菌物質的研究幾近空白。本文以蝶蛹金小蜂毒腺為材料，構建了cDNA文庫

2、，對抗菌肽基因進行篩選，克隆到了新型抗菌肽基因，并將其在不同原核表達系統(tǒng)中表達，初步測定其抑菌活性。結果如下： 1.以蝶蛹金小蜂Ptermalus puparum毒腺為材料，構建了毒腺cDNA文庫。通過X-gal顯色原理測定藍白斑數(shù)量，文庫的重組率為97.6％。對原始文庫進行滴度檢測，結果為8.95×104 pfu/ml，擴增后的滴度為3.1x107 pfu/ml。對隨機挑選的噬菌斑進行PCR擴增，1％瓊脂糖凝膠電泳下顯示外源插

3、入cDNA片段大小在0.3～1.6 kb之間。文庫質量鑒定結果表明，此文庫具有較好的庫容量、較高的重組率及較大的插入片段。 2.采用基于cDNA表達文庫的昆蟲源抗菌肽基因的高效克隆篩選技術。對上述文庫大批量的篩選和重復涂板驗證后，得到3個有一定抑菌效果的陽性克隆。對其進行核苷酸測序，得到的核苷酸序列用BLASTn軟件在GenBank非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫和AMP數(shù)據(jù)庫進行比對，沒有發(fā)現(xiàn)同源性很高的序列，推斷所得克隆是新型抗菌肽基因。

4、 3.將含信號肽序列的PP2a和不含信號肽的PP2b基因在兩種大腸桿菌表達系統(tǒng)pET28a/BL21和pGEX-4T-2/BL21中進行表達。在pET28a/BL21系統(tǒng)中，獲得了高效表達的融合蛋白His-PP2a；在pGEX-4T-2/BL21系統(tǒng)中，獲得了高效表達的融合蛋白GST-PP2b和主要以包涵體形式存在的GST-PP2a。并用抗His抗體和抗GST抗體的Western印跡分析證實了上述融合蛋白的表達。對這些蛋白粗提液