1、真核生物基因組以高度折疊的染色質(zhì)(Chromatin)形式貯存于細(xì)胞核內(nèi)。染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位是核小體(Nucleosome)，其核心部分由大約146-147bp的DNA圍繞著由各兩個(gè)分子的H2A，H2B，H3和H4構(gòu)成的組蛋白八聚體組成。核小體的正確組裝對(duì)于重建有功能的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)十分重要，影響著包括DNA復(fù)制，修復(fù)，重組，轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞增殖與分化以及個(gè)體發(fā)育等諸多生物過(guò)程。核小體組裝需要組蛋白分子伴侶的參與，組蛋白分子伴侶不僅影響著

2、染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)形成及動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)，而且參與到組蛋白的儲(chǔ)存，核質(zhì)運(yùn)輸以及組蛋白在染色質(zhì)組裝過(guò)程中的摻入和替換。
　　 NAP1(Nucleosome Assembly Protein1)是目前被確認(rèn)的在各物種(酵母，動(dòng)物和植物)中都保守存在的組蛋白H2A-H2B分子伴侶。通過(guò)去除/替換染色質(zhì)上的組蛋白H2A/H2B，或者通過(guò)調(diào)節(jié)核小體的滑動(dòng)，NAP1可以改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)及調(diào)節(jié)染色質(zhì)的代謝，進(jìn)而影響細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育等過(guò)程。果蠅和老鼠中的

3、遺傳學(xué)研究結(jié)果表明一個(gè)NAP1同源基因的缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎致死，說(shuō)明了NAP1蛋白在胚胎發(fā)育中的重要功能。NAP1蛋白在植物中也是高度保守的，而目前有關(guān)植物NAP1蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究還處于起步階段。我的博士論文主要利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及遺傳學(xué)等研究手段分析了高等植物NAP1家族成員的功能及其對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響。
　　 我博士論文的第一部分工作主要對(duì)水稻和煙草NAP1家族成員進(jìn)行了分子和生化分析。我們實(shí)驗(yàn)室利用篩

4、選cDNA文庫(kù)的方法，分離到3個(gè)水稻NAP1基因和4個(gè)煙草NAPI基因(Dong et al.，2003.Planta216，561-570)。我們證明了煙草NAP1蛋白可以結(jié)合組蛋白H2A-H2B，我們的結(jié)果支持了NAP1作為H2A-H2B分子伴侶的模式在植物中也是保守的。對(duì)NAP1的結(jié)合蛋白的分析表明煙草NAP1蛋白可以和微管蛋白及有絲分裂細(xì)胞周期蛋白Nicta；CYCB1；1結(jié)合，暗示其在微管動(dòng)力學(xué)調(diào)控上的潛在功能。利用綠色熒光蛋

5、白作為標(biāo)記，我進(jìn)一步研究了水稻和煙草NAP1家族成員的亞細(xì)胞定位。核定位輸出抑制劑LMB處理以及核定位輸出信號(hào)突變實(shí)驗(yàn)表明Orysa；NAP1；1和Nicta；NAP1；1可以在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中穿梭。比較有趣的是，其它三個(gè)煙草NAP1蛋白以及Orysa；NAP1；2只定位于細(xì)胞質(zhì)中，而且并不具有核、質(zhì)穿梭能力。此外，Orysa；NAP1；3缺少典型的核定位信號(hào)，但卻在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有分布。我們還發(fā)現(xiàn)只有Orysa；NAP1；3可以在

6、體外被酪蛋白激酶2(CK2，Casein kinase2)磷酸化。然而，通過(guò)點(diǎn)突變分析，我們卻發(fā)現(xiàn)Orysa；NAP1；3的磷酸化并不影響該蛋白的亞細(xì)胞定位。以上結(jié)果已發(fā)表于Plant Physiology雜志。
　　 由于擬南芥作為模式植物在遺傳分析上具有巨大的優(yōu)勢(shì)，我們轉(zhuǎn)而利用擬南芥系統(tǒng)對(duì)NAP1家族蛋白進(jìn)行功能研究。擬南芥編碼4個(gè)NAP1基因，我們發(fā)現(xiàn)其中一個(gè)基因(AtNAP1；4)特異表達(dá)于雄蕊以及根延長(zhǎng)區(qū)的部分，而其它

7、三個(gè)NAP1基因則全局表達(dá)。更進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)擬南芥NAP1蛋白可以形成同源和異源二聚體，同時(shí)他們也可以結(jié)合植物的組蛋白H2A和H2B。在我們實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)生長(zhǎng)條件下，三個(gè)全局表達(dá)的NAP1基因的缺失的兩個(gè)三突變(Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1和Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2)未表現(xiàn)出任何明顯表型。而通過(guò)各種DNA損傷試劑的處理，我們發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)三突變表現(xiàn)出中等強(qiáng)度的紫外(UV-C

8、)敏感以及體外修復(fù)DNA損傷的能力降低。兩個(gè)三突變的轉(zhuǎn)錄譜和染色質(zhì)免疫共沉淀分析表明擬南芥NAP1蛋白可以直接結(jié)合到一些核苷酸剪切修復(fù)(NEK，Nucleotide excision repair)途徑基因的啟動(dòng)子上，并調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)。這些結(jié)果提示擬南芥NAP1家族成員蛋白保守地行使組蛋白H2A/H2B分子伴侶的功能，并且參與調(diào)節(jié)核苷酸剪切修復(fù)途徑。
　　 有趣的是，三突變的轉(zhuǎn)錄譜還表明，除了核苷酸剪切修復(fù)途徑基因外，某些激

9、素和壓力應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)也發(fā)生了改變，提示我們?nèi)パ芯縉AP1蛋白在植物對(duì)激素和壓力應(yīng)答方面的功能。我們發(fā)現(xiàn)三突變Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-1表現(xiàn)出對(duì)脫落酸(ABA，Abscisic acid)的輕微超敏感。相反，Atnap1；1-1Atnap1；2-1Atnap1；3-2則在苗的生長(zhǎng)和氣孔活動(dòng)方面比較強(qiáng)烈地表現(xiàn)出對(duì)脫落酸的不敏感，并導(dǎo)致該三突變植株鹽耐受性的降低。此外，所有含有Atnapl；3-2等位的

10、突變體以及Atnap1；3-2雜合子都表現(xiàn)對(duì)脫落酸的脫敏性。更細(xì)致的研究表明在所有含有Atnap1；3-2等位的突變體以及Atnap1；3-2雜合子中均存在一個(gè)AtNAP1；3的截短蛋白(碳末端34個(gè)氨基酸缺失，命名為AtNAP1；3T)。過(guò)量表達(dá)這個(gè)截短蛋白導(dǎo)致植物對(duì)脫落酸的脫敏，并導(dǎo)致一些ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因的表達(dá)降低，證實(shí)該AtNAP1；3T可能通過(guò)調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)顯性影響擬南芥對(duì)脫落酸的反應(yīng)。
　　 綜上所述，我的博