1、TFPR1是竹葉青（Trimeresurus flavoviridis）蛇毒CRISPs家族蛋白Triflin的N端PR-1結(jié)構(gòu)域，由163個氨基酸殘基組成。我們在以前的研究中，采用原核表達系統(tǒng)成功表達了該PR-1結(jié)構(gòu)域，并命名為TFPR1蛋白;而且我們發(fā)現(xiàn)TFPR1蛋白對蛋白類抗原具有免疫佐劑活性，可能是一種新型蛋白佐劑。本研究主要針對TFPR1蛋白對不同類型的小分子多肽抗原的免疫增效作用及機制進行深入研究。同時，針對原核系統(tǒng)表達的重

2、組TFPR1蛋白存在復性困難和活性低的問題，探索采用酵母表達系統(tǒng)進行重組表達。
　　1.表達TFPR1的基因工程菌及重組TFPR1蛋白的穩(wěn)定性分析
　　(1) pET-TFPR1質(zhì)粒的穩(wěn)定性及表達TFPR1的穩(wěn)定性分析:對保存2年的甘油菌質(zhì)粒進行雙酶切及測序鑒定目的基因無突變，證明長期保存的表達TFPR1的基因工程菌具備良好的穩(wěn)定性;對重組蛋白TFPR1的誘導表達、純化及復性條件進行分析，結(jié)果表明TFPR1的表達具備穩(wěn)定性。

3、
　　(2)不同條件下貯存的重組蛋白TFPR1穩(wěn)定性分析:在無防腐劑和穩(wěn)定劑條件下，同一批次溶于PBS的重組蛋白TFPR1溶液分別保存在室溫和-20℃，在不同時間（3、12和18個月）時，采用Bradford法檢測蛋白濃度。結(jié)果證明重組蛋白TFPR1的保存具備較好的穩(wěn)定性，適于長期保存。
　　2.重組蛋白TFPR1對不同特性多肽類抗原的免疫增效作用分析
　　(1)重組蛋白TFPR1能夠增強不同特性多肽抗原的免疫原性，但

4、作用強度有所不同:將重組蛋白TFPR1與三種不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)分別進行混合，無需偶聯(lián)，于末次免疫后14天采血，檢測血清抗體滴度及抗體亞類。結(jié)果表明重組蛋白TFPR1能夠顯著增強三種不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)的免疫原性，并且能夠誘導引起Th1型偏倚的Th1/Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)，且高于鋁佐劑，TFPR

5、1對HIV-1MPER多肽的免疫增強作用最弱。
　　(2)重組蛋白TFPR1的佐劑活性與多肽抗原自身特性有關(guān):通過分析多肽抗原的極性、疏水性和分子量等特性與TFPR1作用強度的關(guān)系，初步發(fā)現(xiàn)多肽抗原的極性可能是影響TFPR1佐劑活性的主要因素，疏水性和分子量也是較為重要的影響因素。
　　3.重組蛋白TFPR1發(fā)揮免疫佐劑增效作用的機制研究
　　(1)重組蛋白TFPR1在小鼠體內(nèi)的免疫學活性研究:檢測肌肉注射TFPR1小

6、鼠不同時間血清及注射局部肌肉組織中的細胞因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1可激活小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生細胞因子IL-6、IL-8、IL-10及IFN-γ。
　　(2)重組蛋白TFPR1在小鼠體外激活免疫細胞產(chǎn)生細胞因子:無菌分離小鼠脾細胞，加入重組蛋白TFPR1體外培養(yǎng)24小時后收集上清，ELISA法檢測細胞因子。結(jié)果表明重組蛋白TFPR1能夠在體外激活小鼠免疫細胞產(chǎn)生細胞因子IL-6、IL-10及IFN-γ。
　　(3)重組蛋白TFPR1

7、與抗原遞呈細胞的結(jié)合:采用流式細胞術(shù)檢測重組蛋白TFPR1與小鼠免疫細胞的結(jié)合情況，結(jié)果顯示重組蛋白TFPR1主要與B細胞、巨噬細胞結(jié)合，同時也能夠與T細胞及其他細胞少量結(jié)合。
　　4.重組蛋白TFPR1在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達及活性分析
　　(1)重組畢赤酵母菌株的構(gòu)建:克隆構(gòu)建質(zhì)粒pPICZαA-TFPR1并酶切及測序鑒定，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母系統(tǒng)野生型菌株X33，博來霉素加壓挑選陽性克隆。
　　(2) TFPR1在畢赤酵

8、母系統(tǒng)中的表達與鑒定:采用ELISA法篩選高表達菌株，采用SDS-PAGE及Western blot確定表達蛋白的分子量及其表達產(chǎn)物的特異性。實驗結(jié)果表明TFPR1以分泌形式在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達。
　　(3)酵母系統(tǒng)表達的重組蛋白TFPR1生物學活性的分析:以小鼠脾細胞為模型，檢測表達產(chǎn)物對小鼠免疫細胞的激活作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1能夠激活小鼠免疫細胞產(chǎn)生細胞因子IFN-γ及IL-10，初步證實表達產(chǎn)物具備生物學活性。

9、　　(4)酵母系統(tǒng)表達的重組蛋白TFPR1佐劑活性分析:以雌性BALB/c小鼠為研究對象，對酵母系統(tǒng)表達TFPR1的佐劑活性進行初步分析，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFPR1與多肽類抗原HIV CBD簡單混合免疫小鼠即能夠在短時間內(nèi)增強多肽抗原HIV CBD的免疫原性，初步證明表達產(chǎn)物具備佐劑活性。
　　5.結(jié)論
　　本研究首先分析了TFPR1重組表達基因工程菌及重組蛋白TFPR1的穩(wěn)定性特征，實驗結(jié)果表明原核表達的重組蛋白TFPR1在長

10、期保存中穩(wěn)定性好。其次，以三種不同特性的多肽抗原為基礎(chǔ)，系統(tǒng)進行了重組蛋白TFPR1對小分子多肽抗原免疫增效作用的研究。研究發(fā)現(xiàn)，重組TFPR1蛋白對三種不同特性的多肽類抗原均具有免疫增強作用，但對不同極性特征的多肽的免疫增效作用強度不同。實驗研究表明重組TFPR1蛋白可能通過結(jié)合B細胞、巨噬細胞等抗原遞呈細胞，從而激活免疫細胞產(chǎn)生細胞因子而發(fā)揮佐劑活性。最后，本研究采用畢赤酵母系統(tǒng)成功獲得以可溶性形式表達且具有活性的重組蛋白TFPR1