(一)7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033GI雙點(diǎn)突變體GIGI38P-G247D的構(gòu)建、性質(zhì)的初步分析及通過(guò)穿梭載體實(shí)現(xiàn)其在變鉛青鏈霉菌TK54中的表達(dá);(二)透明顫菌血紅蛋白(VHb)轉(zhuǎn)基因油菜的構(gòu)建及檢測(cè).pdf_第1頁(yè)
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1、在目的蛋白質(zhì)的合適位點(diǎn)引入脯氨酸可以提高其熱穩(wěn)定性.通過(guò)將包含G247D突變的XhoI片斷置換入pTKD-GIG138P中,構(gòu)建了7號(hào)淀粉酶鏈霉菌M1033所產(chǎn)木糖異構(gòu)酶的雙突變體表達(dá)載體.分子模擬顯示,在無(wú)規(guī)卷曲的轉(zhuǎn)折處引入一個(gè)Pro,可以通過(guò)減少蛋白質(zhì)骨架的靈活性而使周?chē)臉?gòu)象結(jié)合得更緊密.將含有G138P單點(diǎn)突變和G138P-G247D雙點(diǎn)突變的GI結(jié)構(gòu)基因,分別克隆入E.coli-鏈霉菌穿梭載體pHZ1272,成功構(gòu)建了穿梭表達(dá)

2、載體pHZGIG138P和pHZGIG138P-G247D.通過(guò)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化,將pHZGIG138P和pHZGIG138P-G247D導(dǎo)入變鉛青鏈霉菌TK54菌株.根據(jù)vhb基因序列設(shè)計(jì)了包含有酶切位點(diǎn)的PCR引物.以pBR322-VHb質(zhì)粒為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增出vhb基因,將補(bǔ)平的PCR片段克隆入表達(dá)載體pBV220,然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株.通過(guò)XbaI和SacI將vhb基因片段切出后連入質(zhì)粒pBI121,即pVHG.在轉(zhuǎn)基

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