1、α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，是由三個(gè)基因編碼的幾十個(gè)亞基組成的大分子酶蛋白。三個(gè)基因分別為sucA，sucB和lpdA。其中sucA編碼α-酮戊二酸脫氫酶，sucB編碼二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶，lpdA編碼二氫硫辛酸脫氫酶，三種亞基分子量大小分別為94,000D、47,000D和54,000D，通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合在一起。具有天然活性的僅．酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的亞基組成為：12個(gè)α-酮戊二酸脫氫酶鏈，24個(gè)二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶

2、鏈以及12個(gè)二氫硫辛酸脫氫酶。實(shí)驗(yàn)表明，24個(gè)二氫硫辛酸轉(zhuǎn)琥珀酰酶鏈可以結(jié)合6個(gè)α-酮戊二酸脫氫酶二聚體和18個(gè)二氫硫辛酸脫氫酶二聚體。然而，只有在結(jié)合6個(gè)二氫硫辛酸脫氫酶二聚體時(shí)α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物才表現(xiàn)出最大的活性。 本文通過(guò)文獻(xiàn)檢索獲得已發(fā)表的大腸桿菌K12全基因組序列，然后以此為依據(jù)設(shè)計(jì)α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物基因引物，以大腸桿菌K12染色體DNA為模板，用PCR技術(shù)分別擴(kuò)增了編碼α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的基因序列

3、sucAB和lpdA。PCR產(chǎn)物純化后，sucAB用EcoR I和Sal I雙酶切，lpdA用Sal I和Hind Ⅲ雙酶切，分別與經(jīng)過(guò)相同酶切處理的質(zhì)粒pUC18連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Ecoli JM109，在含有氨芐青霉素抗性的麥康凱培養(yǎng)基平板上篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)提取質(zhì)粒和酶切驗(yàn)證后，初步證明連接成功。將構(gòu)建好的質(zhì)粒pUC18-sucAB和pUC18-lpdA送上海博亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序后，證明克隆得到的基因序列與所發(fā)

4、表的大腸桿菌K12全基因組序列中相關(guān)序列相同。為了使編碼α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物各基因串連表達(dá)，將質(zhì)粒pUCl8-sucAB和pUC18-lpdA均用EcoR I和Sal I雙酶切，然后回收所需的片斷，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，得到了目標(biāo)質(zhì)粒pUC18-sucAB-lpdA，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliJM109，在含有氨芐青霉素抗性的麥康凱培養(yǎng)基平板上篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。經(jīng)過(guò)提取質(zhì)粒和酶切驗(yàn)證后，證明各基因串連連接成功。大腸桿菌JR

5、G301和JRG465均為a-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株，兩者中編碼a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的部分基因分別被突變，其中JRG301編碼的 lpdA基因發(fā)生突變，JRG465中編碼的sucA基因發(fā)生突變，菌株從而無(wú)法依靠自身基因編碼出完整的具有活性的a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物。為了驗(yàn)證我們構(gòu)建的質(zhì)粒pUC18-sucAB，pUC18-lpdA和pUC18-sucAB-lpdA在大腸桿菌中的表達(dá)活性，將質(zhì)粒pUC18-sucAB轉(zhuǎn)化JRG4

6、65缺陷型菌株，質(zhì)粒pUC18-lpdA轉(zhuǎn)化JRG301缺陷型菌株，質(zhì)粒pUC18-sucAB-lpdA同時(shí)轉(zhuǎn)化JRG465和JRG301兩種缺陷型菌株。成功獲得各轉(zhuǎn)化子后，分別大量培養(yǎng)獲取細(xì)胞，用超聲波法破碎細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)化子細(xì)胞的胞內(nèi)上清液，測(cè)定a-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的酶活性，同時(shí)用大腸桿菌野生型K12、不含質(zhì)粒的缺陷型菌株JRG301和JRG465作為對(duì)照。在JRG465(pUC18-sucAB)中測(cè)得活性，可以證明基因sucAB

7、的表達(dá)。在JRG301(pUC18-lpdA)中測(cè)得活性，可以證明基因lpdA的表達(dá)。在JRG465(pUC18-sucAB-lpdA)和JRG301(pUC18-sucAB-lpdA)中都測(cè)得酶活性，可以證明串聯(lián)基因sucAB-lpdA均得到了表達(dá)。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌a-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中，均測(cè)得比較高的a-酮戊二酸脫氫酶活性，且其表達(dá)量明顯比大腸桿菌野生型K12高，這可能是由于載體質(zhì)粒

8、pUC18的多拷貝所導(dǎo)致的，證明克隆基因在自身啟動(dòng)子的帶動(dòng)下，在大腸桿菌中能夠得到很好的表達(dá)，為下一步在硫細(xì)菌中的表達(dá)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。為了進(jìn)一步證明克隆基因確實(shí)在大腸桿菌僅．酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株JRG465和JRG301中得到了表達(dá)，我們用JRG465(pUC18-sucAB-lpdA) 和JRG301(pUCl8-sucAB-lpdA)菌株破碎細(xì)胞后的上清液進(jìn)行了SDS-PAGE電泳，并用不含質(zhì)粒的缺陷型菌株JR

9、G465、JRG301以及大腸桿菌野生型K12作為對(duì)照，結(jié)果表明,在預(yù)期出現(xiàn)條帶的94，000D、47，000D和54，000D處，含有質(zhì)粒的缺陷型菌株以及野生型K12均出現(xiàn)了比較明顯的條帶，而對(duì)照的缺陷型菌株則沒(méi)有此對(duì)應(yīng)條帶，且在含質(zhì)粒的大腸桿菌α-酮戊二酸脫氫酶基因缺陷型菌株中，其條帶亮度明顯大于大腸桿菌野生型K12，這一結(jié)果與酶活測(cè)定的結(jié)果相符合。但是lPdA和sucB基因編碼的兩種蛋白，由于其分子量只相差7,000D，其分離效果