1、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)是存在于谷物、啤酒、牛奶等食品中的類雌激素霉菌毒素，可嚴重影響動物及人類的健康。研究發(fā)現(xiàn)ZEA不僅具有生殖毒性、肝毒性、遺傳毒性、免疫毒性，還可引起動物睪丸間質腫瘤的發(fā)生，但關于ZEA誘發(fā)睪丸間質腫瘤的機制目前尚不明確。本實驗以小鼠睪丸間質細胞（TM3細胞）為材料，研究了低濃度的ZEA暴露對TM3細胞的細胞增殖活力、細胞凋亡、細胞周期及其相關調控蛋白的影響，DNA損傷及原癌、抑癌基因的影響，

2、細胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響，以揭示ZEA誘發(fā)睪丸間質腫瘤的機制。主要研究內容如下:
　　1.ZEA對TM3細胞增殖、細胞周期及凋亡的影響。不同濃度的ZEA(0、5、10、20μg/L)，染毒TM3細胞72h，應用MTT法檢測ZEA染毒后對TM3細胞增殖活力的影響;AnnexinⅤ-FITC/PI雙熒光染料對細胞進行染色，流式細胞儀檢測ZEA染毒TM3細胞凋亡情況，同時通過PI熒光染色法檢測細胞周期的變化;通過免疫印跡法(W

3、estern Blot)檢測凋亡調控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4，Bcl-2基因家族成員的表達情況。結果顯示，低濃度ZEA對TM3細胞的增殖具有促進作用，且存在劑量-效應關系，在ZEA染毒濃度為20μg/L時，TM3細胞的相對增殖活力明顯提高(P＜0.05);ZEA染毒后，分布于G1/G0期的TM3細胞量逐漸減少，開始向S期和G2期進行轉化，而細胞周期調控蛋白Cyclin D1及其激酶Cdk4蛋白表達量隨ZEA染毒濃度的升高而

4、呈上升趨勢;細胞凋亡檢測結果顯示，10、20μg/L ZEA染毒后TM3細胞的凋亡率極顯著下降(P＜0.01)，但20μg/L ZEA染毒組較10μg/L ZEA染毒組凋亡率略有上升(P＞0.05);與對照組比較，各染毒組凋亡調控蛋白Bax/Bcl-2灰度值比值均顯著降低(P＜0.05)。
　　2.ZEA對TM3細胞DNA損傷及原癌、抑癌基因的調控作用。ZEA染毒TM3細胞72h，應用Western Blot檢測磷酸化組蛋白γH2

5、AX的蛋白表達水平，同時檢測原癌基因c-Myc、 c-Fos、 c-Jun，抑癌基因p53、PTEN的蛋白表達水平;免疫熒光法檢測γH2AX熒光焦點的形成情況。結果顯示，TM3細胞內形成的γH2AX熒光焦點數(shù)量及形成熒光焦點的細胞數(shù)量都隨著ZEA染毒濃度的升高而增加，20μg/L ZEA染毒組只有26.21％的細胞未形成熒光焦點，其余細胞均有不同程度的DNA損傷;與對照組比較，各染毒組γH2AX蛋白表達量均顯著升高(P＜0.05);隨著

6、ZEA染毒濃度的升高，原癌基因c-Myc、c-Fos、c-Jun蛋白表達水平呈上升趨勢，各染毒組與對照組比較均有顯著差異(P＜0.05)，相反抑癌基因p53及PTEN蛋白表達水平則呈下降趨勢，且差異極顯著(P＜0.01)。
　　3.ZEA對TM3細胞間隙連接通訊及其連接蛋白的影響。ZEA染毒TM3細胞72h。Western Blot檢測細胞間隙連接蛋白Cx32、Cx43的蛋白表達水平;FITC熒光染料染色Cx43，在熒光顯微鏡下觀

7、察Cx43在細胞內的分布情況;劃痕標記染料示蹤技術(SLDT法）檢測TM3細胞暴露于ZEA后，相鄰細胞之間GJIC功能的變化。結果顯示，隨著ZEA染毒濃度的升高，TM3細胞連接蛋白Cx32、Cx43的表達量呈下降趨勢，各染毒組與對照組比較均有顯著差異(P＜0.05);熒光顯微鏡下觀察到Cx43在正常細胞內呈現(xiàn)點線狀結構分布于細胞膜周圍，然而在ZEA染毒后Cx43原有的點線狀結構遭受破壞，熒光強度減弱，其分布逐漸趨向于細胞質和細胞核膜上;

8、SLDT技術檢測發(fā)現(xiàn)小分子染料熒光黃(LY)在相鄰細胞間的擴散距離隨著ZEA染毒濃度的升高而呈現(xiàn)縮短趨勢，10μg/L ZEA以上染毒組均較對照組有極顯著差異(P＜0.01)，表明GJIC功能受到了ZEA的抑制。
　　結論認為，低劑量ZEA可引起TM3細胞DNA的損傷，同時伴隨原癌、抑癌基因及凋亡調控蛋白Bal-2、Bax表達的異常及細胞間隙連接通訊的抑制，這些被認為是腫瘤發(fā)生的關鍵機制。ZEA可導致TM3細胞基因組穩(wěn)定性降低，其