1、目的：
　　肝臟是通過(guò)調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝來(lái)維持系統(tǒng)能量平衡的重要臟器。肝臟的脂質(zhì)合成與葡萄糖代謝是密切相關(guān)的，當(dāng)肝臟中的葡萄糖水平超過(guò)肝臟糖原的儲(chǔ)存能力時(shí)，葡萄糖通過(guò)糖酵解、氧化等途徑就轉(zhuǎn)化成游離脂肪酸，作為甘油三酯（Triglycerides，TG）合成的底物，使TG過(guò)多地聚集在肝臟的細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致脂肪性肝的形成。在高濃度葡萄糖（高糖）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性肝細(xì)胞脂肪變性和高糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)的動(dòng)物非酒精性脂肪肝?。∟on-al

2、coholic fatty liver disease，NAFLD）模型中，均可發(fā)現(xiàn)生脂基因固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（ Sterol regulatory element-binding Protein-1c，SREBP-1c），脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase， FASN）和乙酰輔酶 A羧化酶（Acetyl CoA carboxylaseα，ACC1）的表達(dá)增加,TG的含量增多。二甲雙胍作為一磷酸腺苷活化性蛋白激

3、酶（ AMP-activated protein kinase，AMPK）的激動(dòng)劑，能恢復(fù)高糖抑制的AMPK蘇氨酸172位點(diǎn)（AMPK pThr172，是AMPK的磷酸化位點(diǎn)）的活性，減少高濃度葡萄糖引起的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成。鹽誘導(dǎo)激酶1（Salt induced kinase1，SIK1）屬于AMPK家族，參與調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的脂代謝，能直接調(diào)節(jié)SREBP-1c的表達(dá)和活性。在2型糖尿病并發(fā)的非酒精性脂肪肝病的大鼠肝臟中，SIK1

4、的表達(dá)降低，SREBP-1c的表達(dá)增加，TG含量增加。過(guò)表達(dá)SIK1能降低SREBP-1c及其下游生脂基因FASN和ACC1的水平。我們近期報(bào)道了在高濃度葡萄糖孵育的大鼠腎系膜的細(xì)胞系HBZY-1細(xì)胞中，SIK1的mRNA和蛋白水平是降低的，同樣SIK1的活性也是降低的（通過(guò)檢測(cè)SIK1磷酸化位點(diǎn)絲氨酸182位點(diǎn)的蛋白水平，SIK1 pThr182,與其對(duì)應(yīng)的是AMPK pThr172），導(dǎo)致系膜細(xì)胞的增殖。然而，SIK1在高糖誘導(dǎo)的H

5、epG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用，以及二甲雙胍是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)SIK1來(lái)調(diào)控高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積并不清楚。
　　因此，我們采用高糖誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積模型，首次探討SIK1在高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積中的作用，并通過(guò)在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)SIK1和二甲雙胍的干預(yù)，進(jìn)一步研究二甲雙胍是否可以通過(guò)調(diào)節(jié) SIK1來(lái)調(diào)控高糖誘導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。
　　方法：
　　1.人類(lèi)肝癌細(xì)胞

6、系 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有正常糖（5.5 mmol/L D-葡萄糖）、10％胎牛血清（Foetal bovine serum，F(xiàn)BS）、雙抗（100ug/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素）的DMEM培養(yǎng)基中。放進(jìn)濕潤(rùn)環(huán)境的培養(yǎng)箱（二氧化碳濃度為5%，溫度設(shè)置是37℃）中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)融合到大約80%時(shí)，在無(wú)血清的正常糖（葡萄糖的濃度為5.5 mmol/L）培養(yǎng)液中無(wú)血清化24h。然后，HepG2細(xì)胞在高濃度葡萄糖（葡

7、萄糖的濃度為25 mmol/L，高糖）中培養(yǎng)24h誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的模型。HepG2細(xì)胞中的脂滴情況通過(guò)油紅O染色進(jìn)行觀(guān)察，細(xì)胞中TG的含量使用TG試劑盒檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和Western Blot分別檢測(cè)SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)， Western Blot檢測(cè)

8、SIK1 pThr182的蛋白表達(dá)水平（即SIK1的活性），細(xì)胞經(jīng)免疫熒光技術(shù)后，激光共聚焦顯微鏡（Confocal microscopy）下觀(guān)察SIK1在細(xì)胞內(nèi)的分布。
　　2.為了確定SIK1與高糖誘導(dǎo)的脂質(zhì)合成的直接關(guān)系，構(gòu)建重組質(zhì)粒GV230-SIK1，轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞，正常糖培養(yǎng)轉(zhuǎn)染48h后，RT-PCR和Western Blot檢測(cè)SIK1的轉(zhuǎn)染情況。轉(zhuǎn)染48h后的HepG2細(xì)胞，高濃度葡萄糖進(jìn)一步處理24h，細(xì)胞

9、中的脂滴情況通過(guò)油紅O的染色進(jìn)行觀(guān)察，TG在細(xì)胞中的含量通過(guò)使用TG試劑盒檢測(cè)，RT-PCR和Western Blot分別檢測(cè)SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)， Western Blot檢測(cè)SIK1 pThr182的蛋白水平（即SIK1的活性），SIK1在細(xì)胞內(nèi)的分布在Confocal microscopy下進(jìn)行觀(guān)察。
　　3.研究表明二甲雙胍能抑制高糖誘導(dǎo)的肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)合成，為了研究二甲雙

10、胍是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)SIK1來(lái)抑制高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積，我們將HepG2細(xì)胞放在含正常糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，融合至大約80%，用正常糖培養(yǎng)基（不含血清的）進(jìn)行無(wú)血清化培養(yǎng)24h，二甲雙胍預(yù)處理1h，再用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。MTT法觀(guān)察二甲雙胍對(duì) HepG2細(xì)胞存活的影響，觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的脂滴形成情況和甘油三脂的含量，檢測(cè)SIK1、SREBP-1C、FASN、ACC1的mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以及SIK1 pThr182的蛋白水

11、平（即SIK1的活性），SIK1在細(xì)胞內(nèi)的分布在Confocal microscopy下進(jìn)行觀(guān)察。
　　結(jié)果：
　　1.高糖（葡萄糖濃度為25 mmol/L）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24h后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成明顯增加，TG的含量明顯增多；生脂基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達(dá)增加；
　　2.高濃度葡萄糖（25 mmol/L D-葡萄糖）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24h后，SIK1的表達(dá)和活性降低，SIK1從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核

12、轉(zhuǎn)移（SIK1入核）。
　　3.在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)SIK1，會(huì)抑制高糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和生脂基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達(dá)。
　　4.二甲雙胍處理后，會(huì)抑制高濃度葡萄糖誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)合成和脂質(zhì)合成基因SREBP-1c、FASN、ACC1的表達(dá)。
　　5.二甲雙胍能活化SIK1，上調(diào)SIK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平，SIK1部分從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移（SIK1出核）。