1、水稻細(xì)菌性條斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola,Xoc）屬黃單胞屬（Xanthomonas）、水稻黃單胞菌（Xanthomonas oryzae）的一個(gè)致病變種，在水稻（Oryza sativa）上引起細(xì)菌性條斑病(bacterial leaf streak，BLS)，該病害嚴(yán)重威脅到熱帶和亞熱帶地區(qū)的水稻種植。依賴(lài)可擴(kuò)散性信號(hào)分子（diffusible signal factor,DSF）的群體感應(yīng)

2、(quorum sensing，QS)系統(tǒng)是黃單胞屬植物病原細(xì)菌生物學(xué)功能全局性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分，在群體水平上調(diào)控病原菌的毒性因子表達(dá)、生物膜形成等重要生物學(xué)功能。大量成熟生物學(xué)研究技術(shù)手段（例如:核酸測(cè)序、蛋白質(zhì)雙向電泳、質(zhì)譜分析、生物信息學(xué)等）的出現(xiàn)，使得高通量篩選和分析受群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的新穎致病相關(guān)基因變的可行。
　　本研究的目的是分析水稻細(xì)菌性條斑病菌中rpf(regulation of pathogenicity

3、 factors)基因簇的核心基因rpfF、rpfC和rpfG的生物學(xué)功能，利用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)分析DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)對(duì)條斑病菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)組和胞外蛋白質(zhì)組表達(dá)的調(diào)控，鑒定受DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的新穎致病相關(guān)基因，分析這些基因的致病機(jī)制及怎樣受到群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控。
　　首先，為了明確水稻細(xì)菌性條斑病菌是否具有DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)，本研究通過(guò)NCBI BLASTN分析發(fā)現(xiàn)黃單胞屬病原菌中負(fù)責(zé)DSF信號(hào)分子合成、感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)的rp

4、f基因簇是高度保守的。本研究證實(shí)rpfF基因的缺失導(dǎo)致水稻細(xì)菌性條斑病菌徹底喪失合成DSF信號(hào)分子的能力，rpfG基因的缺失導(dǎo)致DSF的合成能力顯著下降，但是rpfC及fpC/rpfG的單雙基因缺失突變均導(dǎo)致DSF超量合成。另外，rpfF、rpfC和rpfG基因的缺失突變均導(dǎo)致水稻細(xì)菌性條斑病菌的致病性喪失。在L液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)時(shí)，野生型菌株Rs05沒(méi)有形成明顯的菌落聚集體，但是rpfF、rpfC、rpfG和rpfC/rpfG單雙基

5、因缺失突變均引起水稻細(xì)菌性條斑病菌細(xì)胞的聚集，形成不同形態(tài)的生物膜。這些結(jié)果表明，水稻細(xì)菌性條斑病菌的rpf基因簇負(fù)責(zé)群體感應(yīng)信號(hào)分子DSF的合成，DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控病原菌的致病性和群體形態(tài)的轉(zhuǎn)化。
　　那么，DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)通過(guò)調(diào)控哪些基因的表達(dá)來(lái)控制水稻細(xì)菌性條斑病菌的致病性是本論文關(guān)注的焦點(diǎn)。接著，本研究利用雙向電泳技術(shù)比較分析了野生型菌株Rs105和rpfF缺失突變株（喪失合成DSF的能力）的胞內(nèi)蛋白質(zhì)組表達(dá)譜，

6、結(jié)果發(fā)現(xiàn)48個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的表達(dá)受到DSF調(diào)控（＞1.5倍）。利用質(zhì)譜技術(shù)成功鑒定了其中的18個(gè)蛋白。利用NCBI和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)這18個(gè)蛋白進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它們涉及多種生物學(xué)功能，例如氮源轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)折疊、活性氧的消除、鞭毛的形成等。選取了其中6個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的基因進(jìn)行了缺失突變，發(fā)現(xiàn)編碼RS27蛋白的基因Xoryp_010100018570(命名為hshB)是水稻細(xì)菌性條斑病菌保持致病性所必需的。
　　RS27是一個(gè)金屬依賴(lài)活性

7、的酰胺水解酶，N末端具有一段信號(hào)肽，它參與次生代謝產(chǎn)物的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和降解。通過(guò)NCBI BLASTN和Southern Blot分析證實(shí)hshB是黃單胞屬細(xì)菌中相對(duì)保守的一個(gè)基因。RT-PCR分析證實(shí)了hshB和它的上游基因Xoryp_010100018565(命名為hshA)組成一個(gè)多順?lè)醋?。隨后的試驗(yàn)結(jié)果表明hshB的缺失突變顯著削弱了水稻細(xì)菌性條斑病菌的毒性、胞外蛋白酶活性、胞外多糖產(chǎn)量、在基本培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力和對(duì)氧化壓力及噻枯

8、唑的耐受性。clp編碼一個(gè)全局性調(diào)控因子Clp(CRP-like protein)，本研究發(fā)現(xiàn)clp缺失突變體與hshB缺失突變體具有類(lèi)似的表型。Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)DSF和clp聯(lián)合正向調(diào)控hshB的轉(zhuǎn)錄，并且hshB的轉(zhuǎn)錄受到貧瘠營(yíng)養(yǎng)條件的誘導(dǎo)。本研究不僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控的新穎致病相關(guān)基因，并且從毒性因子的產(chǎn)生、生長(zhǎng)適應(yīng)性及克服氧迸發(fā)的角度揭示了水稻細(xì)菌性條斑病菌致病性喪失的原因。
　　另外，

9、黃單胞屬病原菌的毒性主要依靠其分泌到細(xì)胞外的各種毒性蛋白因子，并且這些毒性因子的表達(dá)和外泌受到DSF型群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。本研究進(jìn)一步完善了黃單胞菌胞外蛋白的提取和純化方法，獲得了水稻細(xì)菌性條斑病菌的高質(zhì)量胞外總蛋白。然后利用雙向凝膠電泳技術(shù)比較分析了水稻細(xì)菌性條斑病菌野生型菌株Rs105和rpfF缺失突變體（喪失合成DSF信號(hào)分子的能力）胞外蛋白表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)53個(gè)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平受到DSF調(diào)控(＞1.5)，利用質(zhì)譜分析技術(shù)成功鑒定

10、了50個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。利用NCBI和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，其中47個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)對(duì)應(yīng)于水稻細(xì)菌性條斑病菌BLS256菌株全基因組中的32個(gè)基因，它們涉及多種生物學(xué)功能，例如植物細(xì)胞壁降解酶、蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)、鞭毛的形成、活性氧的消除、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、核酸代謝等。對(duì)其中9個(gè)蛋白對(duì)應(yīng)的基因缺失突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多聚半乳糖醛酸酶(B01)和絲氨酸蛋白酶(A03)對(duì)應(yīng)基因的缺失分別顯著削弱了水稻細(xì)菌性條斑病菌對(duì)水稻幼苗的毒力。利用SignalP3.0Server