1、Plastein反應(yīng)又稱(chēng)為合成類(lèi)反應(yīng)或塑蛋白反應(yīng),是蛋白酶催化高濃度的蛋白水解物生成沉淀、觸變膠體或者具有觸變性粘稠膠狀物的過(guò)程;Plastein反應(yīng)可應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和功能特性、補(bǔ)充限制性氨基酸和去除酶解液的苦味等。ACE抑制肽可以通過(guò)抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅰ(ACE)的活性降低血壓,是用于治療高血壓的理想藥物;近些年研究發(fā)現(xiàn)Plastein反應(yīng)修飾可以提高蛋白酶解物的ACE抑制活性,是改善ACE抑制肽活性的新途徑。Plast

2、ein反應(yīng)是一個(gè)綠色的化學(xué)反應(yīng)過(guò)程,具有很大應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展?jié)摿?。但?由于反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜,反應(yīng)機(jī)理尚未明確,限制了它在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。本文以海地瓜蛋白酶解物為原料,利用Plastein反應(yīng)修飾海地瓜酶解物中的ACE抑制肽,以改善其活性,并對(duì)Plastein反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行研究。
　　本文主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.利用Plastein反應(yīng)修飾海地瓜酶解液中的ACE抑制肽,得到修飾肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制活性與原酶解

3、液活性相比,IC50值由0.44 mg/mL降低到0.12 mg/mL;用超濾、Sephadex G-15凝膠層析和RP-HPLC等分離技術(shù)純化 Plastein修飾產(chǎn)物,逐步提高 ACE抑制肽的活性,鑒定所得肽的序列結(jié)構(gòu)為NQNFVQYTTNT(IC50值3.67μmol/L),在肽庫(kù)中檢索沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相同序列,推測(cè)這可能是由Plastein反應(yīng)合成的新肽;通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)軟件SYBYL模擬抑制肽與ACE活性區(qū)域的結(jié)合情況,確定了抑

4、制肽與ACE的結(jié)合位點(diǎn)。
　　2.以Plastein反應(yīng)修飾的抑制肽為研究對(duì)象,研究修飾肽與ACE結(jié)合前后的紫外變化,推測(cè)修飾肽與ACE發(fā)生了有效結(jié)合;通過(guò)測(cè)定修飾產(chǎn)物對(duì)MDCK細(xì)胞的毒性,表明其濃度在10 mg/mL的范圍內(nèi)對(duì)MDCK細(xì)胞沒(méi)有毒性,且低濃度時(shí)還可以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng);經(jīng)胃腸蛋白酶模擬消化后ACE抑制活性是原來(lái)的1.56倍,說(shuō)明修飾肽與胃腸蛋白酶作用后可以進(jìn)一步增強(qiáng)其活性,是前體型藥物;穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明,ACE不影響修飾肽

5、的降壓活性。
　　3. Plastein修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)性質(zhì)表征。通過(guò)紅外光譜和圓二色譜分析,表明酶解物發(fā)生Plastein反應(yīng)后有二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn),如無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊等;熱力學(xué)性質(zhì)研究表明,Plastein反應(yīng)可顯著增加海地瓜酶解物的熱穩(wěn)定性,在分子內(nèi)部和分子間形成較強(qiáng)作用力,使變性溫度由129.86℃升高至134.18℃,焓變?chǔ)由酶解液的21.8 J/g升高至79.7 J/g;X-射線衍射結(jié)果表明,Plastein反應(yīng)使物質(zhì)原

6、有的空間排布發(fā)生改變,形成了新的物質(zhì)結(jié)構(gòu);掃描電鏡結(jié)果表明,Plastein反應(yīng)產(chǎn)物具有類(lèi)似于完整蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu),說(shuō)明Plastein反應(yīng)產(chǎn)物不同于酶解物,它包含較強(qiáng)的作用力并具有一定的空間結(jié)構(gòu)。
　　4. Plastein反應(yīng)機(jī)理的研究。測(cè)定Plastein反應(yīng)過(guò)程中游離氨基酸含量減少及封閉反應(yīng)體系中游離氨基端和羧基端后Plastein反應(yīng)產(chǎn)率下降,證明反應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了縮合反應(yīng);測(cè)定產(chǎn)物中大分子量物質(zhì)沒(méi)有增加,而游離氨基酸含量

7、卻減小,說(shuō)明反應(yīng)機(jī)理中包含轉(zhuǎn)肽作用?？s合作用和轉(zhuǎn)肽作用共同導(dǎo)致新的共價(jià)鍵生成,是Plastein反應(yīng)應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)或肽的功能性質(zhì)方面的主要原因,也使海地瓜酶解液的 ACE抑制活性經(jīng)過(guò) Plastein反應(yīng)修飾后提升。同時(shí)非共價(jià)鍵、疏水交互作用、氫鍵和離子鍵對(duì)形成Plastein修飾產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有重要作用;因此,海地瓜酶解液的Plastein反應(yīng)包括在底物與酶相互作用下由縮合反應(yīng)和轉(zhuǎn)肽反應(yīng)形成新的共價(jià)鍵,與非共價(jià)鍵參與的物理聚集等,共同