1、研究目的:
　　1.研究LIN28基因在三種人胰腺癌細胞株中的表達情況及各細胞增殖和遷移能力的差異;
　　2.研究三種人胰腺癌細胞株中LIN28基因CpG島的DNA甲基化狀態(tài);
　　3.探索甲基化結(jié)合蛋白在三種人胰腺癌細胞株中的LIN28基因CpG島DNA甲基化中的作用;
　　4.探索LIN28基因的表達對人胰腺癌細胞株增殖及遷移能力的影響;
　　研究方法:
　　1.檢測LIN28基因在三種人胰腺癌細

2、胞株中的表達情況及各細胞株的增殖和遷移率
　　1.1在三株人胰腺癌細胞中檢測LIN28的表達
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、中分化的細胞SW1990和PaTu8988，提取細胞內(nèi)總RNA，定量PCR法檢測LIN28基因的mRNA表達水平;提取細胞內(nèi)總蛋白，Western Blot法檢測LIN28基因的蛋白表達水平。
　　1.2檢測胰腺癌細胞株的增殖能力
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、中分化的細

3、胞SW1990和PaTu8988，采用CCK8法檢測上述胰腺癌細胞株的細胞增殖速率。
　　1.3檢測胰腺癌細胞株的遷移能力
　　培養(yǎng)低分化的胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、中分化的細胞SW1990和PaTu8988，采用Transwell小室法檢測上述胰腺癌細胞株的細胞遷移速率。
　　2.檢測三種胰腺癌細胞株中LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)
　　2.1亞硫酸鹽修飾后測序法檢測LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)

4、　　培養(yǎng)胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，提取基因組DNA，采用亞硫酸鹽修飾后測序法檢測上述細胞中LIN28基因CpG島的甲基化狀態(tài)。
　　2.2檢測甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR處理對胰腺癌細胞株中LIN28基因表達的影響
　　培養(yǎng)胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，5-Aza-CdR處理72h，提取總RNA，定量PCR法檢測LIN28基因mRNA水平表達的變化;提取總蛋白，We

5、stern Blot法檢測LIN28基因蛋白水平表達的變化。
　　3.初步探索甲基化結(jié)合蛋白在胰腺癌細胞中LIN28基因CpG島甲基化中的作用
　　3.1檢測甲基化結(jié)合蛋白在胰腺癌細胞中的表達情況
　　培養(yǎng)胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988，Western Blot法檢測各細胞中MeCP2、MBD2、MBD3蛋白的表達。
　　3.2檢測甲基化結(jié)合蛋白對LIN28基因CpG島的轉(zhuǎn)錄抑制
　

6、　采用染色質(zhì)共沉淀法檢測MeCP2和MBD3與LIN28基因CpG島的結(jié)合能力。將干擾質(zhì)粒pLKO.1-puro-shMeCP2和pLKO.1-puro-shMBD3分別轉(zhuǎn)染至PANC1和PaTu8988細胞中，鑒定質(zhì)粒的干擾效果后分別運用定量PCR法和Western Blot法檢測LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達變化。
　　4.探索LIN28基因的表達對胰腺癌細胞增殖和遷移能力的影響
　　4.1鑒定LIN28基

7、因的干擾效果
　　將LIN28干擾質(zhì)粒shLIN28及其對照質(zhì)粒sheGFP分別轉(zhuǎn)染入PANC1細胞中，分別采用定量PCR法和Western Blot法檢測LIN28基因的干擾效果。
　　4.2檢測下調(diào)LIN28基因?qū)σ认侔┘毎鲋澈瓦w移能力的影響
　　將LIN28干擾質(zhì)粒shLIN28及其對照質(zhì)粒sheGFP分別轉(zhuǎn)染入PANC1細胞中，分別采用CCK8法和Transwell小室法檢測其增殖率和遷移率的變化。
　

8、　4.3鑒定LIN28基因的過表達效果
　　將LIN28過表達質(zhì)粒3×Flag-LIN28及其對照質(zhì)粒3×Flag-vector分別轉(zhuǎn)染入PaTu8988和SW1990細胞中，分別采用定量PCR法和Western Blot法檢測LIN28的過表達效果。
　　4.4檢測過表達LIN28對胰腺癌細胞增殖和遷移能力的影響
　　將LIN28過表達質(zhì)粒3×Flag-LIN28及其對照質(zhì)粒3×Flag-vector分別轉(zhuǎn)染入PaT

9、u8988和SW1990細胞中，分別采用CCK8法和Transwell法檢測其增殖率和遷移率的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1.胰腺癌細胞株中LIN28基因的表達與其增殖和遷移率有關(guān)
　　1.1在胰腺癌細胞株中檢測LIN28的表達，SW1990和PaTu8988細胞中LIN28的表達量顯著低于PANC1細胞
　　在胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中檢測LIN28的表達，發(fā)現(xiàn)PANC1細胞中LI

10、N28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達量都明顯高于SW1990和PaTu8988細胞，并且SW1990和PaTu8988細胞中LIN28的表達量極低。
　　1.2在胰腺癌細胞株中檢測各細胞的增殖和遷移率，PANC1細胞明顯高于SW1990和PaTu8988細胞
　　比較胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988的增殖和遷移率，發(fā)現(xiàn)PANC1細胞的增殖和遷移率均顯著高于SW1990和PaTu8988細胞。因此，推

11、測LIN28的表達量可能與胰腺癌細胞的惡性程度有關(guān)。
　　2.胰腺癌細胞株中LIN28基因CpG島的高甲基化抑制其轉(zhuǎn)錄
　　2.1胰腺癌細胞株中LIN28基因CpG島呈高甲基化狀態(tài)
　　對胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因的兩段連續(xù)的CpG島分別進行亞硫酸鹽修飾后測序發(fā)現(xiàn)，上述細胞中LIN28基因的兩段CpG島均呈高甲基化狀態(tài)。PANC1、SW1990和PaTu8988細胞中第一段

12、CpG島的甲基化效率分別為67.69％±2.5％，86.15％±3.5％和98.46％±4％;而相應細胞第二段CpG島的甲基化效率分別為74.60％±3％，83.33％±1.5％和92.85％±2.5％。
　　2.2胰腺癌細胞株中的LIN28基因在甲基化酶抑制劑5-Aza-CdR處理下轉(zhuǎn)錄激活
　　在5-Aza-CdR作用下，胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中的LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表

13、達量均顯著提高。
　　3.甲基化結(jié)合蛋白MeCP2調(diào)控LIN28基因的轉(zhuǎn)錄
　　3.1 MeCP2在胰腺癌細胞中的表達量較高
　　在胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中檢測甲基化結(jié)合蛋白MeCP2、MBD2和MBD3的表達，其中MeCP2和MBD3在上述各細胞株中的表達較高，而MBD2的表達量很低。而MBD3在DNA甲基化中無抑制作用，因此推測，MeCP2可能在LIN28基因的轉(zhuǎn)錄抑制過程中發(fā)揮重要

14、的功能。
　　3.2 MeCP2特異性地結(jié)合甲基化的LIN28基因CpG島
　　以LIN28基因第二段CpG島為模板，結(jié)合染色質(zhì)共沉淀法與普通PCR或定量PCR法，發(fā)現(xiàn)MeCP2能特異性地結(jié)合到甲基化的LIN28基因CpG島。在PANC1和PaTu8988細胞中下調(diào)MeCP2后，LIN28基因在mRNA水平和蛋白水平的表達量均有所提高，驗證了MeCP2對LIN28基因的轉(zhuǎn)錄抑制。
　　4.LIN28基因的表達量與胰腺癌

15、細胞的增殖和遷移能力有關(guān)
　　4.1 LIN28干擾質(zhì)粒能顯著下調(diào)PANC1細胞中LIN28的表達
　　在PANC1細胞中轉(zhuǎn)染LIN28干擾質(zhì)粒后，LIN28在mRNA和蛋白水平的表達量較對照組均明顯下降。
　　4.2下調(diào)LIN28明顯抑制PANC1細胞的增殖和遷移能力
　　下調(diào)LIN28的表達后，PANC1細胞的增殖率和遷移率均顯著下降。
　　4.3 LIN28過表達質(zhì)粒能顯著上調(diào)SW1990和PaTu8

16、988細胞中LIN28的表達
　　在SW1990和PaTu8988細胞中轉(zhuǎn)染LIN28過表達質(zhì)粒后，LIN28在mRNA水平的表達量較對照組明顯增高。實驗組Flag-LIN28融合蛋白檢測陽性，而對照組陰性，提示LIN28過表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染入SW1990和PaTu8988細胞中。
　　4.4上調(diào)LIN28顯著增強SW1990和PaTu8988細胞的增殖和遷移能力
　　上調(diào)LIN28的表達后，SW1990和PaTu898

17、8細胞的增殖率和遷移率均顯著增高。
　　研究結(jié)論:
　　1.LIN28表達于低分化的胰腺癌細胞株P(guān)ANC1中，而在中分化的SW1990和PaTu8988細胞中的表達量極低。
　　2.胰腺癌細胞株P(guān)ANC1、SW1990和PaTu8988中LIN28基因CpG島的高甲基化導致其轉(zhuǎn)錄抑制，而PANC1細胞的甲基化效率明顯低于SW1990和PaTu8988細胞。
　　3.甲基化結(jié)合蛋白MeCP2調(diào)控胰腺癌細胞中LIN2