1、第一部分:青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶是實(shí)現(xiàn)酶法轉(zhuǎn)化青霉素生產(chǎn)各種半合成頭孢菌素的關(guān)鍵前體7-ADCA的關(guān)鍵酶。獲得對(duì)青霉素 G具有高催化能力的擴(kuò)環(huán)酶突變體，是將其引入工業(yè)化生產(chǎn)需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室利用定點(diǎn)突變和靶向突變的方法對(duì)來(lái)源于棒狀鏈霉菌的青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶進(jìn)行改造，以達(dá)到對(duì)青霉素 G的轉(zhuǎn)化活性提高的目的，從而更好的應(yīng)用于7-ADCA的合成。突變位點(diǎn)的選擇是在分析酶與底物青霉素 G復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，先使用RasWin觀察所選擇殘基與底物及

2、附近殘基的相互作用，根據(jù)其性質(zhì)和空間大小選擇可能的突變，然后再使用Swiss PDB Viewer的側(cè)鏈構(gòu)象搜索工具進(jìn)行突變體構(gòu)象的模擬。從底物結(jié)合口袋中選擇了11個(gè)位點(diǎn)并設(shè)計(jì)了有利的突變傾向，將其中8個(gè)組合為4個(gè)組合突變庫(kù)，另外3個(gè)位點(diǎn)采用定點(diǎn)突變研究。我們利用抑菌圈生物活性測(cè)定方法以及HPLC檢測(cè)青霉素?cái)U(kuò)環(huán)酶對(duì)青霉素 G轉(zhuǎn)化率的方法，從中篩選到 Y184A、S261A、S261M、R72T73、V72T73、T72T73六株生物活性

3、提高的突變株。
　　第二部分:來(lái)源于產(chǎn)黃頭孢(Acremonium chrysogenum)的擴(kuò)環(huán)/羥化雙功能酶(acDAOC/DACS)可催化底物青霉素 N擴(kuò)環(huán)生成脫乙酰氧基頭孢菌素 C(DAOC)和進(jìn)一步羥化生成脫乙酰頭孢菌素 C(DAC)。對(duì)位于底物進(jìn)出口通道處的R308位點(diǎn)氨基酸殘基進(jìn)行飽和突變，從中篩選得到了R308I、R308L、R308T和R308V四種活性得到提高的突變體，結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，將 R308突變?yōu)閹в卸痰氖?/p>