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![SARS相關(guān)冠狀病毒Spike蛋白定點(diǎn)突變和細(xì)胞融合報(bào)導(dǎo)系統(tǒng)載體構(gòu)建.pdf_第1頁](https://static.zsdocx.com/FlexPaper/FileRoot/2019-3/19/13/d50b9394-d7d2-437a-ad46-ee91d6b32a9e/d50b9394-d7d2-437a-ad46-ee91d6b32a9e1.gif)
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文檔簡介
1、SARS-CoV是正義單鏈病毒,基因組全長約為29.7kb。它是一種與之前所報(bào)道的各種冠狀病毒不同的新的病毒,是引起2002-2003年全球爆發(fā)的人類嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)的元兇。 本文主要研究SARS-CoV中的其中一個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白——刺突蛋白(S)。在SARS-CoV引起的細(xì)胞膜融合過程中,S蛋白起著至關(guān)重要的作用。S蛋白與受體的結(jié)合親和力如何,直接決定病毒對(duì)靶細(xì)胞的感染活性,同時(shí)S蛋白也是SARS-CoV的一個(gè)重要的抗
2、原位點(diǎn),針對(duì)這一抗原位點(diǎn)的深入研究可以為疫苗研究尋求有效的靶點(diǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究根據(jù)對(duì)SARS不同來源株的S蛋白的核苷酸多序列的比對(duì),計(jì)算其相應(yīng)位點(diǎn)的突變墑值和突變幾率后,結(jié)合進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析(核苷酸和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)比較、結(jié)構(gòu)域等二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及蛋白質(zhì)折疊、功能預(yù)測等),先從數(shù)十個(gè)突變熱點(diǎn)中篩選出經(jīng)預(yù)測可能影響S蛋白與其受體結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致SARS病毒對(duì)宿主細(xì)胞的膜融合侵染能力的7個(gè)位點(diǎn),參照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物和突變引物,利用重疊延
3、伸PCR法(OE-PCR)或直接PCR法進(jìn)行人工定點(diǎn)突變。 研究中先將S蛋白的讀碼框(ORF)序列利用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ、PstⅠ、HindⅢ、SalⅠ、Bgl Ⅱ和ClaⅠ切割成五個(gè)DNA片段并亞克隆至經(jīng)相同酶切的pSP72中問載體中,針對(duì)經(jīng)序列分析確定的7個(gè)突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)突變引物分別進(jìn)行單個(gè)位點(diǎn)的定點(diǎn)突變體的構(gòu)建,獲得相應(yīng)的突變體,繼而構(gòu)建野生型和突變體的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(PLNCX2)系統(tǒng)PLNCX2/Spike。
4、 通過以上實(shí)驗(yàn),已成功獲得了SARS-CoV Spike野生型和七個(gè)位點(diǎn)突變型的PLNCX2載體的重組子,可為研究這些突變位點(diǎn)在Spike蛋白與受體結(jié)合中的意義,進(jìn)而可為闡述Spike蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、揭示Spike蛋白變異與SARS病毒侵入(染)細(xì)胞能力的相關(guān)性提供堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究細(xì)胞膜融合蛋白與受體的結(jié)合的方法多用細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn),為了能有效地觀察細(xì)胞-細(xì)胞融合的效果,建立了T7 RNA聚合酶/T7啟動(dòng)子載體系統(tǒng)。設(shè)計(jì)引
5、物從大腸桿菌BL21中擴(kuò)增T7 RNA聚合酶基因序列,并將后者插入真核表達(dá)載體pRc/CMV2中,構(gòu)建質(zhì)粒pRc/CMV2-T7P,作為T7 RNA聚合酶的供體,而T7 RNA聚合酶特異識(shí)別的T7啟動(dòng)子序列則通過人工合成,并插入帶有報(bào)告基團(tuán)——熒光素酶的表達(dá)載體pGL3中,構(gòu)建質(zhì)粒pGL3-T7。因?yàn)閜GL3質(zhì)粒雖然含有熒光素酶序列,但因?yàn)槿狈τ行У腞NA聚合酶,所以不能單獨(dú)表達(dá);而RNA聚合酶的作用又必需由pGL3-T7中的T7啟動(dòng)子
6、啟動(dòng)。利用將T7 RNA聚合酶的表達(dá)序列和T7 RNA聚合酶啟動(dòng)子分別構(gòu)建于不同的載體中,將兩質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞,可以此來觀察兩者之間的融合情況。如果它們有融合,則可表達(dá)熒光素酶蛋白,可用熒光素酶底物檢測到,反之則無表達(dá)。 本研究已成功構(gòu)建以上載體,并共轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞和VERO E6細(xì)胞,可在細(xì)胞裂解液中檢測到熒光素酶蛋白的表達(dá),說明此系統(tǒng)是可用的。構(gòu)建的系統(tǒng)可廣泛應(yīng)用于細(xì)胞與細(xì)胞的融合研究中,是一個(gè)非常實(shí)用的工具系
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