1、目的：1.研究Rho激酶抑制劑Y-27632對大鼠骨髓間充質干細胞(Bone-marrbwmesenchymal stem cells，BMSCs)分裂增殖和細胞周期的影響。
　　2.研究Rho激酶抑制劑Y-27632聯(lián)合表皮刺激因子(EGF)和堿性成纖緇細胞生長因子(bFGF)，能否促進大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞。
　　方法：1.采用改良的貼壁細胞培養(yǎng)法：體外分離培養(yǎng)SD大鼠BMSCs，96孔板中培養(yǎng)，取生長

2、狀態(tài)良好的第二代BMSCs，調整細胞濃度為1×105/孔，隨機分為實驗組和對照組：實驗組分別用2.5Bμmol/L、5.0μmmol/L、10.0μmmol/L、20.0μmmol/L濃度梯度的Y-27632與含10％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基共培養(yǎng)96h；對照組僅用含10％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)。四甲基偶氮唑藍[MTT]法檢測細胞的增殖，并繪制細胞生長曲線，明確Y-27632促進BMSCs增殖的最佳濃度；用流式細胞儀檢

3、測細胞生長周期的變化。
　　2.取純化后的第三代大鼠BMSCs于6孔板中用含濃度為2％B27的Neurobasal無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)72h后，隨機分為：常規(guī)誘導組(EGF+bFGF)，Y-27632聯(lián)合常規(guī)誘導組(Y-27632+EGF+bFGF)，連續(xù)培養(yǎng)48h。顯微鏡下觀察細胞的生長情況，免疫熒光雙標染色法分別檢測誘導分化的BMSCs中神經(jīng)元特異性稀醇化酶(NSE)和膠質纖維酸性蛋白(GFAP)的表達，并計算單位視野內NSE、G

4、FAP陽性細胞數(shù)目；Western-blot檢測NSE、GFAP表達水平。統(tǒng)計分析聯(lián)合應用Y-27632對誘導大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的影響。
　　結果：1.Y-27632對BMSCs細胞增殖與生長的影響：
　　(1)對增殖的影響大鼠BMSCs培養(yǎng)24h，各組細胞吸光度(OD)值均維持在較低水平，各濃度組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；細胞培養(yǎng)48h，各組細胞OD值明顯上升，其中，10.0μmol/L組

5、細胞吸光度值升高明顯，與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而其他實驗組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；培養(yǎng)至96h，實驗組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，且10.0μmol/L組與其他濃度組相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明Y-27632可以促進大鼠BMSCs的增殖，其促增殖效應與作用濃度有關，其中10.0μmol/L促進BMSCs增殖效應優(yōu)于20.0μmol/L和5.0μmol/L。

6、r>　　(2)對細胞周期的影響流式細胞術檢測：對照組G0/G1期細胞比例為(80.640±5.516)％，S期細胞比例為(13.397±2.511)％；實驗組G0/G1期細胞比例為(61.723±8.829)％，S期細胞比例為(29.380±7.630)％，實驗組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　2.聯(lián)合應用Y-27632促進大鼠BMSCs分化為神經(jīng)元和膠質細胞兩組BMSCs細胞誘導12h，倒置顯微鏡可見培養(yǎng)細

7、胞胞體回縮，折光性增強，部分細胞出現(xiàn)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞樣外觀；誘導24h，熒光顯微鏡可見同一細胞中NSE、GFAP兩種物質共表達。誘導48h，BMSCs向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質細胞系分化，其中常規(guī)誘導組，單位視野內NSE陽性細胞數(shù)量數(shù)為(83.200±8.677)個，GFAP陽性細胞數(shù)量數(shù)為(96.30±8.486)個；Y-27632聯(lián)合誘導組，NSE陽性細胞數(shù)量數(shù)為(109.20±8.430)個，GFAP陽性細胞數(shù)量數(shù)為(107.50±8

8、.683)個；兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Western-blot檢測結果顯示；BMSCs誘導分化48h，誘導分化的細胞均表達NSE、GFAP兩種蛋白，而Y-27632聯(lián)合誘導組與常規(guī)誘導組相比，NSE、GFAP蛋白的表達均上調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結論：本實驗條件下，
　　1.Y-27632可以促進大鼠BMSCs的增殖，其最佳濃度為10.0μmol/L；
　　2.Y-27632可以促