1、弓形蟲(Toxoplasma gondii)是一種專性細胞內寄生的醫(yī)學原蟲，能感染幾乎所有恒溫動物(包括人類)，引起弓形蟲病。在免疫功能正常的宿主體內通常形成包囊，造成隱性感染；但當宿主免疫功能下降時(如腫瘤患者、器官移植者及AIDS患者等)，弓形蟲可在宿主體內播散引起弓形蟲病甚至導致宿主死亡。弓形蟲感染也是家畜家禽流產、畸胎、死產的主要原因之一，對畜牧業(yè)生產危害嚴重。剛地弓形蟲膜表面蛋白1(SAGl)是弓形蟲速殖子期特異性抗原，能夠誘

2、導機體產生IgG、IgM、IgA抗體和CD8+T細胞殺傷弓形蟲。已有研究表明，弓形蟲的主要表面抗原1具有很強的免疫原性，是弓形蟲診斷和疫苗研究的重要候選抗原分子。SAGl抗原在原蟲含量較低，因此用基因工程技術在體外表達P30蛋白，然后利用該蛋白作抗原，建立剛地弓形蟲ELISA抗體檢測方法。 本實驗參考Genbank登錄的剛地弓形蟲(Toxoplasma．gondii)P30全基因序列，設計合成一對引物，通過PCR在剛地弓形蟲的基

3、因組DNA中擴增出P30的相應片段，然后構建T-A克隆，經PCR擴增和酶切鑒定后進行測序。再亞克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，構建了重組質粒pET-32a(+)/P30并轉化DH5a感受態(tài)細胞，于含有氨芐青霉素的LB平板上篩選陽性克隆，再經PCR擴增和酶切鑒定重組質粒。然后將重組質粒pET-32a(+)qP30轉化表達菌BL21(DE3)，用IPTG誘導成功表達出分子量為48.3kDa的融合蛋白，經Western-blotti

4、ng鑒定目的蛋白具有良好的免疫學活性，為研究重組蛋白的免疫原性奠定了基礎。 重組T.gondii P30蛋白經過鎳柱純化后，作為抗原包被聚苯乙烯微量反應板，初步建立了豬弓形蟲抗體的間接ELISA檢測方法。對ELISA的最佳反應條件進行優(yōu)化，結果表明T.gondii P30蛋白抗原的最適包被濃度為2.75μg/ml，最適封閉液為5％脫脂乳，檢測血清稀釋度為1:640，抗原和抗體的作用時間為1h，HRP-兔抗豬IgG的最適工作濃度為