1、目的：通過siRNA干擾技術(shù)設(shè)計5-LOX(5-脂氧合酶,5-lipoxygenase)siRNA,檢測被轉(zhuǎn)染的人肝癌細胞株HepG2中5-LOX表達的變化。研究5-LOX siRNA對裸鼠移植瘤生長的抑制作用和對通路蛋白ERK1/2的影響,進一步探討體內(nèi)5-LOX基因表達受抑對腫瘤生長的抑制作用及其作用的機制,從而進一步拓寬肝癌的發(fā)病機理,為肝腫瘤的基因?qū)W治療提供依據(jù)和靶點。并探討RNAi技術(shù)在肝腫瘤的研究和防治中的價值。
　　

2、方法：人工合成針對5-LOX的干擾RNA,并在細胞水平上將5-LOX siRNA對人肝癌細胞株 HepG2進行轉(zhuǎn)染實驗。細胞實驗分成三組:①陽性干擾組(轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA干擾質(zhì)粒)②陰性對照組(轉(zhuǎn)染空白載體質(zhì)粒)③空白組(正常肝癌細胞不作任何轉(zhuǎn)染)。于瞬時轉(zhuǎn)染48h,收集細胞,做實時免疫熒光定量PCR檢測。免疫熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后的細胞HepG2中5–LOX基因表達明顯受抑,驗證轉(zhuǎn)染效果確切后,再用上述三組細胞接種裸鼠皮下建

3、立裸鼠移植瘤模型。實驗裸鼠也隨機分三組:①轉(zhuǎn)染組(接種陽性干擾組HepG2細胞)、②轉(zhuǎn)染空載體組(接種陰性對照組HepG2細胞)、③未轉(zhuǎn)染組(接種空白組HepG2細胞)。接種21天后處死裸鼠,取出瘤體,測量腫瘤最長的長徑和與之垂直的短徑,按下式計算腫瘤體積(腫瘤體積(V)=長徑×短徑2×0.5)和腫瘤衰退率=轉(zhuǎn)染干預組平均腫瘤體積比/未轉(zhuǎn)染組平均腫瘤體積(V/Vo)。應用蛋白免疫印跡法Western-blot檢測5-LOX, ERK1/

4、2等通路蛋白水平的變化,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應RT-PCR檢測5-LOX,ERK1/2的mRNA表達改變。
　　結(jié)果：①在細胞轉(zhuǎn)染水平上應用熒光定量PCR技術(shù)檢測陽性干擾組siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌HepG2細胞后5-LOX的表達量相對定量結(jié)果為0.341,明顯較陰性對照組相對定量結(jié)果0.822和空白組相對定量結(jié)果1.074降低(P<0.01)。②在動物實驗組測量轉(zhuǎn)染組裸鼠腫瘤平均體積為(10.660±4.552)cm3與轉(zhuǎn)染空載體組平均體

5、積(19.576±6.081)cm3及未轉(zhuǎn)染組平均體積(20.465±8.395)cm3比較明顯減小(P<0.01),轉(zhuǎn)染組腫瘤衰退率52.09％。③檢測轉(zhuǎn)染組腫瘤瘤體5-LOX、ERK1、ERK2蛋白表達(相對系數(shù))分別為0.167±0.015、0.187±0.006、0.183±0.015與轉(zhuǎn)染空載體組0.427±0.015、0.367±0.153、0.323±0.021及未轉(zhuǎn)染組0.443±0.021、0.390±0.030、0.

6、343±.015相比明顯下降(P<0.01),而5-LOX、ERK1、ERK2基因mRNA的表達強度(相對系數(shù))分別為0.198±0.021、0.193±0.023、0.127±0.026,與轉(zhuǎn)染空載體組0.408±0.047、0.398±0.020、0.297±0.027及未轉(zhuǎn)染組未轉(zhuǎn)染組0.410±0.026、0.400±0.021、0.293±0.029相比下降值具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：①siRNA干擾基

7、因表達是一種切實可行基因沉默方法之一,經(jīng)過5-LOX siRNA轉(zhuǎn)染人肝癌細胞HepG2,在細胞水平上檢測5-LOX的mRNA表達明顯受到抑制。②體內(nèi)實驗抑制5-LOX表達可顯著抑制肝細胞肝癌瘤體的生長。③抑制5-LOX表達測得腫瘤瘤體組織中5-LOX及信號通路蛋白ERK1/2表達下降,結(jié)果提示抑制5-LOX的表達明顯抑制腫瘤的生長,其作用機制可能通過抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinas