1、本文研究目的：采用骨組織工程技術(shù)，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)為種子細(xì)胞，轉(zhuǎn)染bFGF基因后，觀察bFGF對(duì)體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖分化的影響；轉(zhuǎn)染bFGF基因的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，以珊瑚人工骨為支架進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，觀察支架的細(xì)胞相容性，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 研究材料與方法： 1.MSCs的獲取及純化培養(yǎng)：穿刺抽取新西蘭大白兔脛骨骨髓，采用密度梯度離心法分離MSCs

2、，再采用貼壁篩選法對(duì)分離出的MSCs進(jìn)行純化。 2.MSCs成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)：對(duì)獲得的部分MSCs用礦化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)培養(yǎng)20天，進(jìn)行Vonkossa染色。 3.bFGF-pcDNA3重組表達(dá)質(zhì)粒的提?。篋H-5α菌(含牛bFGF-pcDNA3真核表達(dá)載體)擴(kuò)增，用UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，并對(duì)所得質(zhì)粒酶切鑒定。 4.bFGF-pcDNA3轉(zhuǎn)染MSCs：利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染bFGF-pcDNA3到MSCs，

3、G418篩選獲得抗性克隆。培養(yǎng)擴(kuò)增后進(jìn)行免疫組化和western-blot檢測(cè)鑒定表達(dá)產(chǎn)物。 5.轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖特性檢測(cè)：利用MTT法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖活力，并繪制生長(zhǎng)曲線：利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增值周期。 6.轉(zhuǎn)染細(xì)胞同珊瑚人工骨的復(fù)合培養(yǎng)：將轉(zhuǎn)染細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，滴加至珊瑚表面復(fù)合培養(yǎng)，電鏡觀察珊瑚骨表面細(xì)胞的生長(zhǎng)情況；利用MTT法檢測(cè)復(fù)合培養(yǎng)情況下轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖活力。 研究結(jié)果： 1.獲得大量形

4、態(tài)均一的MSCs，部分細(xì)胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，Vonkossa染色可見(jiàn)黑色結(jié)節(jié)。 2.獲得bFGF-pcDNA3重組表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，重組質(zhì)粒含有bFGF目的基因片斷。 3.脂質(zhì)體介導(dǎo)bFGF-pcDNA3重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MSCs，獲得G418抗性克隆，經(jīng)免疫組化和western-blot檢測(cè)，證實(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞確實(shí)表達(dá)bFGF，并且表達(dá)部位在胞漿。 4.轉(zhuǎn)染細(xì)胞增值活力加強(qiáng)，生長(zhǎng)曲線上移，處于增殖周期的細(xì)胞比例加大

5、。 5.掃描電鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞在珊瑚支架上生長(zhǎng)良好，MTT檢測(cè)表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞在珊瑚支架生長(zhǎng)未受到抑制。 研究結(jié)論： 1.通過(guò)密度梯度離心和貼壁篩選相結(jié)合的方法可以成功分離獲得MSCs。 2.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法能將bFGF-pcDNA3重組真核表達(dá)載體成功導(dǎo)入體外培養(yǎng)的MSCs，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)bFGF的MSCs，自身表達(dá)的bFGF可以促進(jìn)MSCs增殖。 3.珊瑚人工骨具有良好的細(xì)胞相容性，具有廣闊的應(yīng)用前