1、背景與目的： β地中海貧血(簡稱β地貧)是世界上最常見的常染色體單基因隱性遺傳病之一。β地貧在全球許多地區(qū)具有很高的發(fā)生率，目前公認(rèn)的原因是由于瘧疾選擇的結(jié)果。因此地貧主要分布在瘧疾高發(fā)的熱帶亞熱帶地區(qū)，從地中海沿岸和非洲大部分地區(qū)到中東、印度次大陸、中國南方、東南亞、并延伸至印度尼西亞和太平洋地區(qū)，而美國、中美和南美等國因移民原因也成為高發(fā)地區(qū)。β地貧是我國長江以南各省區(qū)高發(fā)的血液遺傳病，廣東、廣西、海南、江西、臺灣和香港等地

2、尤為突出，受累人口多達(dá)2億以上。 β地貧是由于β-珠蛋白基因突變導(dǎo)致β-珠蛋白肽鏈缺如(β°)或合成不足(β<'+>)而引起的遺傳性溶血性貧血病。β地貧的分子病理具有高度的異質(zhì)性，主要為11號染色體上β-珠蛋白基因點突變、小的缺失或插入。目前全世界已報道的基因突變類型達(dá)200多種，不同種族人群有其自身的常見突變類型。重型β地貧是致死性疾病，患者必需通過定期輸血和去鐵治療來維持生命，因此，β地貧仍是這些高發(fā)地區(qū)最關(guān)心和最棘手的公共

3、健康問題之一。對于一個地貧高發(fā)的地區(qū)或國家而言，控制該病的最有效途徑是在遺傳流行病學(xué)研究的基礎(chǔ)上制訂預(yù)防計劃，通過實施大人群的篩查和高風(fēng)險夫婦的產(chǎn)前診斷來防止重癥患兒的出生。 β地貧的基因診斷和產(chǎn)前診斷先后經(jīng)歷了DNA點雜交、限制性內(nèi)切酶酶譜分析、限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)連鎖分析、寡核苷酸探針雜交(Allele Specific Oligo

4、nucleotide，ASO)和基因芯片(Gene Chip)等技術(shù)。目前，用于診斷β地貧的分子生物學(xué)方法主要為經(jīng)典的反向點雜交(Reverse Dot Blot，RDB)技術(shù)。但上述方法存在操作煩瑣，對引物標(biāo)記、探針合成及標(biāo)記技術(shù)要求較高，診斷速度慢，不適合進(jìn)行大人群篩查，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果并進(jìn)一步導(dǎo)致誤診或者漏診等缺點。高效液相色譜技術(shù)(Denaturing high-performance liquid chromatog

5、raphy，DHPLC)已被證明是一種精確、高效、經(jīng)濟(jì)、高通量自動化的檢測己知點突變及篩查未知突變的方法。其敏感性和特異性可達(dá)96％～100％，明顯高于常用的DGGE、CCM、CSGE、SSCP等變異檢測技術(shù)，目前只有基于毛細(xì)管電泳技術(shù)發(fā)展起來的熒光單鏈構(gòu)像多態(tài)性分析(F-SSCP)在敏感性和特異性方面能與DHPLC相媲美。另外，若同時選多個溫度條件進(jìn)行分析還能進(jìn)一步增加DHPLC的變異檢出率。 本研究的目的是基于DHPLC上述

6、特點，建立一種快速、高靈敏度、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量自動化的β地貧診斷方法，用于已知β地貧點突變的快速基因診斷和產(chǎn)前診斷以及發(fā)現(xiàn)新的突變位點或單核苷酸多態(tài)性位點(Single NucleotidePolymorphisms，SNPs)。 設(shè)計與方法： 針對中國人群β地貧已知35種突變類型及其在β珠蛋白基因中的位置，設(shè)計三對涵蓋所有突變熱點區(qū)的特異性聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)引物

7、，通過條件優(yōu)化實現(xiàn)在同一條件下的常規(guī)PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物在DHPLC半變性條件下，對同源雙鏈或異源雙鏈進(jìn)行分析，不同基因型表現(xiàn)為洗脫峰峰型的差異和/或保留時間長短的差異。795例基因組DNA樣品作為本方法學(xué)建立的基礎(chǔ)，其中包括407例經(jīng)RDB確診的患者基因組DNA樣品和388例正常人基因組DNA樣品。 隨機(jī)抽取其中的319例基因組DNA樣品進(jìn)行測序分析，作為盲法對照實驗，用于評價本方法的準(zhǔn)確性。這319例DNA樣品包括258例

8、β地貧點突變或點突變復(fù)合多態(tài)性位點的DNA樣品和61例正常DNA樣品。此外，經(jīng)DHPLC分析獲得的與已知突變峰型不同的樣品，通過DNA測序以期發(fā)現(xiàn)新突變或SNP位點。本方法建立及評價完成后，將其用于β地貧的臨床產(chǎn)前診斷，并與RDB診斷方法的結(jié)果進(jìn)行比對，得出本方法的實用性。 結(jié)果與討論： 本研究共檢測分析了795例DNA樣品，這些樣品中包含了20種不同β珠蛋白基因突變類型和8個多態(tài)性位點。通過DHPLC方法檢測分析，得到

9、了68種不同的特異性洗脫峰標(biāo)準(zhǔn)圖譜。在盲法對照實驗中，得到了與DHPLC檢測方法完全一致的分析結(jié)果。同時在實驗過程中，還檢測到了4例用常規(guī)分析手段未檢測出的新突變，這4例新突變均為首次報道。此外還發(fā)現(xiàn)一例-98突變，但其是否對β地貧構(gòu)成貢獻(xiàn)有待進(jìn)一步研究。應(yīng)用DHPLC對9例中國家系進(jìn)行產(chǎn)前診斷的結(jié)果與RDB方法診斷結(jié)果完全一致。 本研究建立的基于DHPLC的β地貧已知突變基因診斷技術(shù)是一種高通量、高靈敏度、自動化、快速、準(zhǔn)確、