1、研究背景： 支氣管哮喘是一種氣道慢性炎癥性疾病，輕度兒童哮喘的多數(shù)能控制良好，中重度哮喘部分難以控制，其機(jī)制不明，因此深入研究中重度兒童哮喘的炎癥機(jī)制有望改善其療效。哮喘發(fā)病過(guò)程中氣道重塑是其中特征性表現(xiàn)，既往認(rèn)為參與氣道重塑的炎癥細(xì)胞以嗜酸性粒細(xì)胞為主，現(xiàn)已有研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘誘導(dǎo)痰中其它炎性細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞比例明顯增高，其中以中性粒細(xì)胞炎性反應(yīng)最多。 迄今為止，支氣管哮喘慢性炎癥、氣道

2、重塑的細(xì)胞機(jī)制尚未完全清楚。輔助性T細(xì)胞(helper T lymphocyte，Th)1/Th2平衡理論及白介素5(interleukin—5，IL—5)驅(qū)動(dòng)的嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil，EOS)氣道炎癥學(xué)說(shuō)占據(jù)主導(dǎo)地位，近年發(fā)現(xiàn)EOS炎癥理論無(wú)法解釋一些重癥哮喘病理現(xiàn)象，并有資料顯示輔助性T細(xì)胞如Th17及中性粒細(xì)胞可能參與了哮喘的慢性炎癥過(guò)程。 過(guò)度活化的Th2細(xì)胞產(chǎn)生的IL—5引起嗜酸性粒細(xì)胞的活化、趨化，嗜酸性

3、粒細(xì)胞能合成和分泌大量的細(xì)胞毒素及促炎性介質(zhì)，引起一系列的組織損傷，如上皮細(xì)胞的缺損，血漿外滲，氣道高反應(yīng)性及組織炎癥的啟動(dòng)和維持，最終導(dǎo)致肺功能的紊亂和缺失，但在NEA亞型中IL—5作用如何尚無(wú)報(bào)道。 IL-17于1995年首先從CD4+T文庫(kù)中克隆，多種細(xì)胞均可產(chǎn)生IL-17，但主要還是來(lái)源于Th17。IL-17的主要生物學(xué)功能是介導(dǎo)中性粒細(xì)胞促進(jìn)炎性反應(yīng)，與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、哮喘、多發(fā)性硬化癥、銀屑病和移植排斥反應(yīng)密切相關(guān)

4、。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外實(shí)驗(yàn)顯示，Th17活化后產(chǎn)生IL-17，在粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，G—CSF)的共同作用下誘導(dǎo)骨髓CD34+干細(xì)胞分化成中性粒細(xì)胞，刺激中性粒細(xì)胞活化、聚集至氣道，并抑制中性粒細(xì)胞凋亡。中性粒細(xì)胞可產(chǎn)生彈性蛋白酶(Neutrophil elastase，NE)、蛋白水解酶—3(caspase—3)、基質(zhì)金屬蛋白酶—9(Matrix Metallopr

5、oteinase9，MMP—9)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子—β(transforming growth factor—β，TGF—β)等介質(zhì)，參與氣道及肺組織的損傷和纖維化。 中性粒細(xì)胞與Th17在支氣管哮喘發(fā)病中的作用機(jī)制仍未研究清楚，Th-17作為CD4+T細(xì)胞調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞參與哮喘發(fā)病的中介備受關(guān)注，有研究報(bào)道成人哮喘患者體內(nèi)的IL-17水平明顯高于正常人。另有資料顯示以中性粒細(xì)胞炎癥為主的哮喘對(duì)目前以吸入性糖皮質(zhì)激素(inhaled

6、 corticosteroids，ICS)為主的聯(lián)合治療效果差，深入研究中性粒細(xì)胞及Th17在兒童中重度哮喘中的作用，可望為難治性哮喘尋求新的治療靶點(diǎn)。 最近有研究通過(guò)胸部高分辨CT(high—resolution computed tomography，HRCT)檢查測(cè)定成人氣道壁面積和厚度，結(jié)果顯示哮喘患者氣道壁厚度、氣道壁面積與氣道總截面積之比明顯高于健康對(duì)照者，哮喘患者的支氣管壁厚度與病情嚴(yán)重度成正相關(guān)。作為無(wú)創(chuàng)性檢查，

7、高分辨CT用于兒童哮喘的氣道重塑評(píng)估，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。 研究目的： 1.通過(guò)對(duì)哮喘患兒痰液及血液的研究了解IL—5及IL-17在兒童中重度哮喘中的作用； 2.探討HRCT用于評(píng)估哮喘兒童氣道重塑情況的可能性。 研究對(duì)象與方法： 1.研究對(duì)象 選擇中重度支氣管哮喘患兒65例，其中急性發(fā)作期哮喘患兒為45例，緩解期哮喘患兒為20例，20例緩解期患兒均經(jīng)正規(guī)聯(lián)合治療達(dá)到臨床緩解。急性發(fā)作期按誘導(dǎo)痰

8、的細(xì)胞分類分為嗜酸細(xì)胞性哮喘(eosinophilic asthma，EA)組25例及非嗜酸細(xì)胞性哮喘(non—eosinophilic asthma，NEA)組20例。該組患者按兒童哮喘嚴(yán)重度分級(jí)均屬于三、四級(jí)患兒，分為中度持續(xù)組20例；重度持續(xù)組25例。臨床緩解期患兒按誘導(dǎo)痰的細(xì)胞分類分為嗜酸細(xì)胞性哮喘組10例及非嗜酸細(xì)胞性哮喘組10例。選取8例病程較長(zhǎng)的病人于其臨床緩解期行胸部高分辨CT，8例患者病程范圍為3～8年，病程中位數(shù)為4

9、.5年。 同期健康兒童20例設(shè)為正常對(duì)照者。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，兩組男女比例、年齡均存在可比性。 2.研究方法 2.1誘導(dǎo)痰的采集、處理：由噴射式霧化儀吸入3％高張鹽水10～15min，將咳出的痰液收集至約1ml，取粘稠部分痰液加入適量的裂解液(0.1％DTT)，混勻后水浴并振蕩十分鐘；將痰液用40μm濾網(wǎng)過(guò)濾，2500轉(zhuǎn)離心10分鐘(300-1500g×5-10min)，細(xì)胞沉渣置于PBS中涂片，以甲醇固定，分別經(jīng)HE

10、染色和White Giemasa染色，計(jì)數(shù)200個(gè)非上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分類，分類計(jì)算中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的百分比。 2.2外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離和培養(yǎng)： 1)靜脈采血2ml，EDTA抗凝，PBS等體積稀釋，緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液上，2500轉(zhuǎn)離心20分鐘； 2)吸取中間白膜層，以PBS充分洗滌后，以2000轉(zhuǎn)離心10分鐘，加入RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整PBMC密度為1×109/L；

11、 3)將 PBMC1x109細(xì)胞/L培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板中，200ul/孔，加入anti—CD3(OKT3)(0.2mg/L)+antiCD28(1mg/L)進(jìn)行共培養(yǎng)； 4)培養(yǎng)板置于37℃，5％CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后收集上清存放至—80℃冰箱。 2.3外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)上清IL—5、IL-17的測(cè)定：通過(guò)酶聯(lián)免疫法(Enzyme—Linked ImmunoSorbent Assay，

12、ELISA)測(cè)定PBMC培養(yǎng)上清IL—5、IL-17水平，單位為pg/ml。 2.4血常規(guī)、血細(xì)胞形態(tài)、IgE水平的測(cè)定 1)血常規(guī)：靜脈采血2ml到醫(yī)院檢驗(yàn)室完成。 2)血細(xì)胞形態(tài)：靜脈采血1ml涂片后，經(jīng)HE染色和White Giemasa染色，分類計(jì)算中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的百分比并觀察各細(xì)胞的形態(tài)。 3)外周血免疫球蛋白E(IgE)測(cè)定：抽取外周血1～2ml后，離心分離出血清

13、， 通過(guò)ELASA檢測(cè)血清中IgE含量，IgE濃度單位是IU/ml。 2.5支氣管壁厚度測(cè)量 1)取吸氣末三個(gè)橫斷層面：主動(dòng)脈弓上、氣管分叉、下肺靜脈，橫斷圖像上每個(gè)層面選取雙側(cè)管腔內(nèi)徑0.5～2mm的氣道各三支，由放射科醫(yī)師測(cè)量管腔內(nèi)徑L、管腔外徑D； 2)在計(jì)算機(jī)上通過(guò)程序計(jì)算氣道壁的厚度T(T=(D-L)/2)、氣道壁厚度與氣道管腔外徑之比值T/D、氣道壁面積WA[WA=π(D/2)2-π(L/2)

14、2]、氣道壁面積占?xì)獾揽偨孛娣e的百分比WA％=[π(D/2)2-π(L/2)2]/π(D/2)2x100％。 2.6肺功能測(cè)量 觀察指標(biāo)：用力肺活量(FVC)、第一秒用力呼氣量(FEV1)、第一秒用力呼氣量/用力肺活量比值(FEV1/FVC)、75％呼氣中期流量(MEF75％)、50％呼氣中期流量(MEF50％)、25％呼氣中期流量(MEF25％)、最大呼氣峰流速(PEF)。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 符合正態(tài)分布

15、連續(xù)性計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±s)表示，兩組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用方差分析；雙變量相關(guān)分析采取變量間pearson相關(guān)分析；P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均使用SPSS16.0軟件包進(jìn)行分析。 結(jié)論： 1.根據(jù)誘導(dǎo)痰炎癥細(xì)胞的不同，可將兒童支氣管哮喘分為嗜酸細(xì)胞型和非嗜酸細(xì)胞型。 2.IL—5參與哮喘發(fā)病，并與病情分度相關(guān)；IL—5水平與外周血、誘導(dǎo)痰嗜酸性粒細(xì)胞比例成正相

16、關(guān)；IL—5在EA中的作用較NEA更為突出。 3.IL-17參與哮喘發(fā)病，并與病情分度相關(guān)；IL-17水平與外周血、誘導(dǎo)痰中性粒細(xì)胞比例成正相關(guān)；IL-17在NEA中的作用較EA更為突出。 4.IgE參與EA發(fā)病，與哮喘患兒外周血、誘導(dǎo)痰EOS比例成正相關(guān)。 5.支氣管哮喘患兒氣道壁厚度與氣道管腔外徑之比值T/D、氣道壁面積占?xì)獾揽偨孛娣e的百分比WA％與FEV1、MEF25％～75％成顯著負(fù)相關(guān)，與IL-17水平