1、脂肪組織不僅在個(gè)體發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮必要作用，并且在牛肉品質(zhì)的研究中也扮演著重要角色。培育生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛肉的肉牛品種已成為目前分子育種的重要目標(biāo)。牛肉中脂肪含量決定了牛肉的品質(zhì)。但由于脂肪組織形成和沉積的分子作用機(jī)制復(fù)雜，在牛上對(duì)脂肪沉積相關(guān)基因的研究相對(duì)較少，有待挖掘;并且基因的可變剪接豐富了其表達(dá)產(chǎn)物的種類，加大了基因作用機(jī)制的復(fù)雜程度，同時(shí)也為分子機(jī)制的研究提供了新思路，成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。為此，本研究對(duì)不同發(fā)育階段和不同性別秦川牛的皮下

2、脂肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和基因差異表達(dá)分析，并在組織、細(xì)胞和分子水平上對(duì)差異表達(dá)基因逐步篩選得到脂肪沉積相關(guān)基因，最后利用電子克隆、基因組織表達(dá)譜構(gòu)建、脂肪細(xì)胞分化基因時(shí)序表達(dá)分析、細(xì)胞共定位及亞細(xì)胞定位分析等手段進(jìn)一步研究了可變剪接的組織特異性以及可變剪接對(duì)脂肪沉積相關(guān)基因功能的影響。主要研究結(jié)果如下:
　　1.牛皮下脂肪組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因表達(dá)分析
　　本研究利用二代高通量測(cè)序分別對(duì)胎牛、成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂

3、肪組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。每個(gè)樣品獲得至少2，600萬(wàn)clean reads，其中82.58％～84.41％的clean reads成功的比對(duì)到參考基因組上。我們共檢測(cè)了12，233個(gè)基因在四類皮下脂肪組織內(nèi)的表達(dá)，其中109個(gè)基因在四類皮下脂肪組織中共同高表達(dá)（≥500 RPKM）。共同高表達(dá)的基因中除了含有63個(gè)編碼核糖體蛋白的基因外，還包含多個(gè)與脂肪代謝相關(guān)的基因(APOE、GAPDH、FABP4、SPARC和ADIRF等)，說(shuō)明共同

4、高表達(dá)的基因可以為篩選脂肪沉積相關(guān)基因提供材料。不同性別成年牛皮下脂肪組織基因表達(dá)高度相關(guān)（r≥0.91），胎牛和各成年牛皮下脂肪組織基因表達(dá)相關(guān)程度較低（r≤0.64）;并且通過(guò)對(duì)四類皮下脂肪組織兩兩比較差異基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)本研究中年齡相對(duì)性別對(duì)皮下脂肪組織基因的表達(dá)影響更大。此外，我們還在四類牛脂肪組織中檢測(cè)到大量新轉(zhuǎn)錄本，這為將來(lái)完善?；蚪M注釋及非編碼RNA的研究提供資源。
　　2.年齡和性別對(duì)脂肪組織基因表達(dá)差異的

5、影響
　　通過(guò)將成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織作為三個(gè)重復(fù)與胎牛皮下脂肪組織的基因表達(dá)進(jìn)行比較，共檢測(cè)到2，703個(gè)差異表達(dá)基因(差異表達(dá)倍數(shù)＞2，P＜0.05)。成年牛和胎牛皮下脂肪組織差異基因GO(Gene ontology，基因功能注釋)富集分析顯示，差異基因顯著富集（P＜0.05）在與組織發(fā)育相關(guān)的GO條目;脂肪代謝相關(guān)的GO條目沒(méi)有顯著富集，但具有較低的P值。差異基因顯著富集在脂肪代謝關(guān)鍵信號(hào)通路PPAR pa

6、thway，其中促進(jìn)脂肪沉積的基因在成年牛皮下脂肪組織中顯著上調(diào);另外，14個(gè)脂肪細(xì)胞成脂分化標(biāo)志基因中有12個(gè)基因在成年牛皮下脂肪組織內(nèi)相對(duì)胎牛皮下脂肪組織高表達(dá)，說(shuō)明成年牛皮下脂肪組織相對(duì)胎牛皮下脂肪組織進(jìn)行著更為活躍的脂肪沉積。對(duì)成年公牛、成年母牛和成年閹牛皮下脂肪組織兩兩比較差異基因進(jìn)行功能和參與的信號(hào)通路富集分析發(fā)現(xiàn)，差異基因在與甾類激素刺激、脂肪代謝和細(xì)胞因子相關(guān)的GO條目顯著富集，在和細(xì)胞因子相關(guān)的信號(hào)通路共同顯著富集，這

7、初步證明性別對(duì)牛皮下脂肪組織的脂肪代謝有影響，并且可能和細(xì)胞因子的分泌相關(guān)。
　　3.脂肪沉積相關(guān)基因的篩選
　　基于以上對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)的分析結(jié)果，選取11個(gè)在成年牛皮下脂肪組織內(nèi)均為胎牛皮下脂肪組織內(nèi)表達(dá)量10倍以上的基因和20個(gè)在四類牛皮下脂肪組織內(nèi)共同高表達(dá)的基因，作為后續(xù)逐步篩選與脂肪沉積相關(guān)基因的初始材料。通過(guò)構(gòu)建31個(gè)候選基因的組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)其中12個(gè)基因(ADIPOR2、CIDEC、GHR、LIPE、S10

8、0B、SCD、THRSP、TUSC5、ANXA2、CST3、SPARC和VIM)在脂肪組織內(nèi)相對(duì)其它組織高表達(dá)。通過(guò)羅格列酮對(duì)牛原代脂肪細(xì)胞進(jìn)行脂肪沉積誘導(dǎo)，檢測(cè)到其中7個(gè)基因(GHR、THRSP、SCD、LIPE、TUSC5、CIDEC和CST3)在脂肪沉積過(guò)程中表達(dá)呈上調(diào)趨勢(shì)。利用腺病毒在牛原代脂肪細(xì)胞中超表達(dá)PPARG2，檢測(cè)到其中3個(gè)基因(CIDEC、TUSC5和CST3)表達(dá)量顯著上調(diào)。最終，本實(shí)驗(yàn)篩選出3個(gè)受PPARG2調(diào)控

9、且與脂肪沉積相關(guān)的基因，同時(shí)補(bǔ)充了牛PPARG2基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。
　　4.脂肪組織內(nèi)表達(dá)基因可變剪接特征分析
　　在以上轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)4，753個(gè)基因存在可變剪接現(xiàn)象，占總檢測(cè)基因數(shù)目的38.85％。但只有1，319(28％)個(gè)基因在四類牛脂肪組織中均出現(xiàn)可變剪接現(xiàn)象，并且共同出現(xiàn)可變剪接的基因只有17％的可變剪接事件在四類牛脂肪組織內(nèi)同時(shí)存在，說(shuō)明可變剪接在脂肪組織的不同發(fā)育時(shí)期或不同性別的個(gè)體內(nèi)存在較大差異。本研

10、究選擇牛NFIX基因?qū)勺兗艚拥慕M織特異性進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。通過(guò)電子克隆及PCR方法成功預(yù)測(cè)并驗(yàn)證牛NFIX基因存在5種不同轉(zhuǎn)錄本。組織表達(dá)譜分析顯示不同轉(zhuǎn)錄本在牛不同發(fā)育時(shí)期和不同組織內(nèi)表達(dá)出現(xiàn)多樣化的差異。以上分析說(shuō)明同一基因的不同亞型可能會(huì)具有不同功能，因此有必要進(jìn)一步分析可變剪接對(duì)脂肪沉積相關(guān)基因表達(dá)和分布的影響。
　　5.脂肪沉積相關(guān)基因可變剪接模式及細(xì)胞定位分析
　　本實(shí)驗(yàn)分析了三個(gè)脂肪沉積相關(guān)基因（CEBPA、

11、CIDEC和TUSC5）的可變剪接模式，并通過(guò)細(xì)胞定位分析或細(xì)胞共定位分析在239T或3T3-L1細(xì)胞中檢測(cè)可變剪接對(duì)以上三個(gè)基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)分布影響。結(jié)果顯示:CEBPA的兩種蛋白亞型均分布在細(xì)胞核內(nèi);CIDEC的兩種蛋白亞型均分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，并且在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布未發(fā)現(xiàn)差異;TUSC5的兩種蛋白亞型均分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，但在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布出現(xiàn)明顯差異。對(duì)TUSC5產(chǎn)生的兩種蛋白亞型氨基酸序列進(jìn)一步分析顯示，可變剪接可能通過(guò)改變TUSC5

12、的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)影響其在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布。
　　6.可變剪接對(duì)脂肪沉積相關(guān)基因TUSC5作用的影響
　　對(duì)TUSC5不同亞型(TUSC5a和TUSC5b)的組織表達(dá)譜和在牛原代脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化不同階段表達(dá)變化趨勢(shì)分析，均發(fā)現(xiàn)TUSC5a和TUSC5b存在一定的差異;并且利用細(xì)胞定位載體檢測(cè)TUSC5a和TUSC5b在293T細(xì)胞內(nèi)的時(shí)序表達(dá)，發(fā)現(xiàn)TUSC5a相對(duì)TUSC5b出現(xiàn)明顯的遲緩表達(dá)。但亞細(xì)胞定位分析顯示TUSC5a和