1、目的：
　　 軟骨組織損傷是近年來常見的疾病，創(chuàng)傷及非創(chuàng)傷性的病理損傷為其常見病因，由于軟骨結(jié)構由Ⅱ型膠原相互交織形成三維網(wǎng)狀結(jié)構及包埋其中的蛋白多糖及軟骨細胞所構成，而且軟骨組織內(nèi)沒有血管及軟骨細胞的增生及遷移能力有限，因此軟骨損傷后的軟骨自身修復能力差。目前臨床上沒有較好的方法來治療軟骨缺損，近年來利用組織工程學方法治療軟骨缺損成為研究的熱點之一。而組織工程學所應用的種子細胞主要包括成體干細胞及自體軟骨細胞。自體軟骨細胞由于

2、存在細胞數(shù)目少、移植后遠期效果不佳以及供區(qū)可發(fā)生并發(fā)癥等問題，而影響了其在臨床的應用。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)是骨髓中除了造血干細胞之外的另一類成體干細胞，具有多向分化潛能，在不同的條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、成肌細胞及神經(jīng)細胞，但目前由于沒有特異性的表型，其鑒定尚無統(tǒng)一標準，大多數(shù)鑒定依賴于其形態(tài)水平、功能特征及培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的分化表型來協(xié)助鑒

3、定骨髓間充質(zhì)干細胞。由此成功分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞，并誘導分化為成軟骨細胞，對治療軟骨損傷具有重要意義。本實驗采用體外培養(yǎng)擴增、鑒定兔骨髓間充質(zhì)干細胞，利用其分化潛能，觀察其誘導分化為成軟骨細胞的可行性。
　　 方法：
　　 1.BMSCs的分離純化與培養(yǎng)：取3月齡健康新西蘭大耳白兔6只，行雙側(cè)脛骨結(jié)節(jié)平臺穿刺抽取骨髓5mL，以1.073g/ml密度Percoll分離液結(jié)合密度梯度離心法分離純化骨髓間充質(zhì)干細胞(bon

4、e marrow mesenchymal stem cells，bMSCs)，懸浮于含體積分數(shù)為10％胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基(含青霉素100U/mL，鏈霉素100U/mL)，輕輕吹打均勻，接種到25cm2培養(yǎng)瓶，置37℃，體積分數(shù)為5％C02及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按1：2比例傳代培養(yǎng)。
　　 2.BMSCs生長曲線的測定：取第3代生長良好的細胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成細胞懸液，以每孔細胞濃度為1×108 L-1分別

5、接種于24孔板中的各孔，每孔1mL，置于37℃、體積分數(shù)為5％C02及飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。于第2天起每日取3孔，去除培養(yǎng)液，胰酶消化后制備成細胞懸液，以細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，計算平均值，以細胞數(shù)為縱坐標，時間為橫坐標繪制細胞生長曲線。
　　 3.BMSCs的細胞表面標志鑒定：細胞生長接近融合時，取第5代生長良好的細胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，用PBS緩沖液沖洗2遍，并制備成(5~10)×108L L-1濃度的細胞懸液，取

6、0.1mL細胞懸液置于不同離心管中，各個離心管中分別加入CD29、CD44、CD45的一抗，37℃孵箱孵育20min后，以PBS緩沖液沖洗2遍后，加入二抗37℃孵箱孵育20min，沖洗后重懸細胞于0.5mLPBS緩沖液中為流式細胞分析用。
　　 4.BMSCs向成軟骨細胞的誘導：取第3代生長良好的兔BMSCs，以1×108 L-1的細胞濃度接種于內(nèi)含蓋玻片的12孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h后，待細胞完全貼壁，將細胞設為對照組和誘導組，

7、對照組繼續(xù)以含體積分數(shù)為10％胎牛血清的α-MEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)，誘導組換成含成軟骨誘導劑的H-DMEM培養(yǎng)液(含TGF-I10μg/L、IGF-I110μg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白6.25mg/L、地塞米松10mmol/L、維生素C0.05mmol/L)，每2d或3d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。誘導21d后免疫細胞化學染色，觀察細胞Ⅱ型膠原表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.細胞形態(tài)學觀察原代細胞2d或3d首次換液后

8、，可見少量單個核細胞貼壁生長，多為短柱性或多角形。4d或5d全量換液，去除大量漂浮的細胞，可見分散的BMSCs小集落，細胞逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形，胞核為圓形或橢圓形，胞漿內(nèi)可見較多的顆粒。6~9d時細胞迅速生長，小集落逐漸融合成大集落，可呈輻射狀生長，10~14d細胞大部分融合，達90％以上，細胞形態(tài)均勻，長梭形，排列緊密，呈旋渦狀或菊花狀。傳代培養(yǎng)后，細胞形態(tài)更為均一，排列更加整齊，增殖速度明顯加快，6~8d細胞可融合達90％以上，可再行傳

9、代。
　　 2.BMSCs生長曲線細胞生長2d內(nèi)處于潛伏期，生長緩慢，3~5d進入對數(shù)增長期，呈對數(shù)增長，6~8d處于平臺期，細胞鋪滿瓶底，增殖緩慢。
　　 3.流式細胞結(jié)果分析
　　 3.1原代細胞流式細胞分析結(jié)果：原代細胞有62.4％的細胞表達CD29，有60.3％的細胞表達CD44，有2.79％的細胞表達CD45。
　　 3.2傳代細胞的流式細胞分析：第3代有99.9％的細胞表達CD29，有99.6

10、％的細胞表達CD44，有2.62％的細胞表達CD45。
　　 4.II型膠原免疫細胞化學染色BMSCs誘導21d后可見Ⅱ型膠原陽性細胞較多，陽性位置位于胞漿內(nèi)，呈棕黃色至棕褐色細密顆粒，在胞核周圍更加明顯。平行培養(yǎng)未誘導的BMSCs棕黃色顆粒不明顯，著色較淺，陽性細胞數(shù)目較少。
　　 結(jié)論：
　　 1.本實驗首次通過流式細胞術顯示原代細胞與第3代細胞各因子表達情況不同，原因可能是原代細胞通過密度梯度離心法分離后，

11、仍有部分其他細胞伴隨培養(yǎng)，隨著細胞的擴增傳代，雜細胞逐漸減少，BMSCs的純度越來越高，第3代細胞高度表達CD29、CD44而不表達CD45，表明所培養(yǎng)的BMSCs是單一的細胞群，不含造血細胞等其他細胞，其純度較高。
　　 2.本實驗研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細胞在含TGF-β1和IGF-Ⅰ的誘導培養(yǎng)液中誘導后體外擴增能力明顯降低，誘導21d后形態(tài)變化比較顯著，Ⅱ型膠原免疫組化染色明顯。
　　 3.本實驗應用密度梯度離心法可成