1、目的:研究將TGF-β1基因真核表達(dá)型質(zhì)粒pCMV6-TGF-β1-GFP與膠原/殼聚糖支架復(fù)合,制作成基因激活基質(zhì)的方法,探索基因激活基質(zhì)對誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化的作用,為關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 1 基因激活基質(zhì)的制備:2％的膠原和3％的殼聚糖醋酸溶液按7:3比例混合均勻,倒入模具中,-20℃預(yù)冷凍10h,放入冷凍干燥機(jī)中凍干24h,在支架上加載pCMV6-TGF-β1-GFP質(zhì)粒,

2、再次凍干,最后用交聯(lián)劑在室溫下交聯(lián)2小時(shí),制備成基因激活基質(zhì),用掃描電鏡和液體置換法檢測其孔徑大小和孔隙率。
　　 2 脂肪干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和傳代:無菌條件下取兔雙側(cè)腹股溝處皮下脂肪組織約10毫升,剔除血管后,充分剪碎,0.1％的Ⅰ型膠原酶在37℃下振蕩消化1.5小時(shí),用含10％胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基終止消化,200目濾網(wǎng)濾過,離心,棄上清,再用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,計(jì)數(shù),接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、飽和濕度、5％CO2的培養(yǎng)

3、箱中培養(yǎng)。48小時(shí)后首次換液,以后每三天換液一次,8-10天達(dá)到約80％融合時(shí)按1:3的比例首次傳代。以后每次待細(xì)胞生長至約80％融合時(shí)進(jìn)行下一次傳代。
　　 3 基因激活基質(zhì)復(fù)合脂肪干細(xì)胞體外培養(yǎng):取第4代脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞,與基因激活基質(zhì)復(fù)合。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組A和對照組B,A組用基因激活基質(zhì)支架,B組用不含質(zhì)粒成分的膠原/殼聚糖支架。細(xì)胞支架復(fù)合物置于12孔板內(nèi),用不含胎牛血清的LG-DMEM完全培養(yǎng)基于37℃、飽和濕度、5％

4、CO2條件下培養(yǎng),每3天換液一次。MTT法檢測細(xì)胞在支架上的生長狀況。
　　 4 檢測基因激活基質(zhì)的轉(zhuǎn)染效果:支架接種細(xì)胞培養(yǎng)24h后,用熒光顯微鏡觀察支架內(nèi)部是否有綠色熒光發(fā)出。培養(yǎng)7d,取標(biāo)本在EP管中裂解,勻漿,然后添加1ml的Trizol,按照說明書提取總的RNA。用RT-PCR檢測TOF-β1表達(dá)。接種后第1、4、7、10、13d用ELISA法檢測培養(yǎng)基中TGF-β1蛋白的含量。
　　 5 細(xì)胞支架復(fù)合物的電鏡

5、觀察和免疫組織化學(xué)檢測:培養(yǎng)3d、7d、14d,分別取標(biāo)本用掃描電鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況,取第14d標(biāo)本,進(jìn)行免疫組織化學(xué)及生物學(xué)的相關(guān)檢測。
　　 結(jié)果:
　　 1 基因激活基質(zhì)的孔徑與孔隙率:基因激活基質(zhì)的孔徑約為100-150um,平均為120um左右,孔間相通性好,孔隙率為(86.7±1.5)％。
　　 2 兔脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:原代脂肪干細(xì)胞24h貼壁,細(xì)胞呈長梭形或多角形,第3天開始呈克隆樣生長

6、,第7-10天達(dá)到80-90％融合,傳代細(xì)胞生長明顯加速,5-7天可以達(dá)到80-90％融合,生長活躍,并呈典型的漩渦樣生長。
　　 3 基因激活基質(zhì)的轉(zhuǎn)染效果:支架接種細(xì)胞培養(yǎng)24h后,熒光顯微鏡觀察顯示實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)部有綠色熒光發(fā)出,這種熒光現(xiàn)象一直持續(xù)到14d,而對照組無。培養(yǎng)7d時(shí),取復(fù)合物提取總RNA,用RT-PCR檢測TGF-β1表達(dá),結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組有表達(dá),而對照組無。接種后第3、6、9、12、15d用ELISA法檢測培

7、養(yǎng)基中TGF-β1蛋白的含量,實(shí)驗(yàn)組在7d時(shí)檢測水平最高,14d時(shí)仍有表達(dá),而對照組無。
　　 4 電鏡觀察和免疫組織化學(xué)檢測:脂肪干細(xì)胞與基因激活基質(zhì)復(fù)合48h后,用掃描電鏡觀察標(biāo)本,可見基因激活基質(zhì)表面布滿細(xì)胞,細(xì)胞呈梭形黏附于支架上,孔隙內(nèi)已有部分細(xì)胞呈集落狀生長。培養(yǎng)2周后,掃描電鏡可見細(xì)胞形態(tài)向多角形,不規(guī)則型轉(zhuǎn)化,體積增大,周圍出現(xiàn)較多量細(xì)胞外基質(zhì)。對照組細(xì)胞多呈纖維狀生長,細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外基質(zhì)均較少。Ⅱ型膠原免疫組