1、惡性腫瘤是人類尚未攻克的醫(yī)學難題，絕大多數(shù)癌癥給人類帶來巨大的生命威脅。目前對惡性實體腫瘤的治療仍以手術切除和放化療為主，在清除癌細胞的同時給機體帶來傷害甚至是致命的打擊。基因治療研究逐漸成為熱點。研究腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制可以為開發(fā)新的治療手段提供理論依據(jù)和實驗基礎。microRNA，一個不足30個核苷酸的微小分子以其復雜的信號網(wǎng)絡和對細胞的多方面生物學行為影響成為醫(yī)學科學研究領域的另一熱點。它和腫瘤疾病之間的密切聯(lián)系已經(jīng)為人們所熟知

2、，而其中具體的分子機制研究卻并不透徹。腫瘤細胞自身所特有的物質能量代謝特征，其中隱藏的分子機制可以作為治療腫瘤的一個切入點。本課題期望在已有的研究成果上，深入分析miRNA和惡性腫瘤之間包括表達、物質能量代謝等多方面的調(diào)控關系，為尋找新的腫瘤治療靶點探明機制。
　　 第一部分：Ras信號通路對miRNA表達調(diào)控的研究
　　 目的：研究Ras信號通路對miRNA表達的調(diào)控作用及其分子機制。
　　 方法：以RAS蛋白

3、轉化的NIH3T3細胞和正常NIH3T3細胞為研究對象，利用microRNA芯片技術篩選兩株細胞中差異表達的miRNAs，利用real-timePCR技術驗證芯片結果。選出表達改變較為明顯的6個miRNAs應用普通PCR和real-timePCR檢測其不同結構體的表達水平。通過分析不同結構體的表達水平，尋找其差異表達的原因。通過構建包含miRNA基因啟動子區(qū)域熒光報告載體分析miRNA基因啟動子活性，研究其受調(diào)控的可能分子機制。

4、　　 結果：①microRNA芯片篩選到大量差異表達的miRNAs；②real-timePCR驗證芯片結果，挑選表達改變較為明顯的6個miRNAs進行后續(xù)研究；③不同結構體表達水平的分析表明6個miRNAs受到了轉錄水平的調(diào)控；④啟動子區(qū)域熒光報告載體熒光素酶活性分析獲得有活性的啟動子片段。
　　 結論：RAS蛋白轉化的NIH3T3細胞中存在與正常NIH3T3細胞不同的miRNAs表達調(diào)控機制，使得miRNA發(fā)生了差異表達。<

5、br>　　 第二部分：microRNA與腫瘤細胞谷氨酰胺代謝調(diào)控
　　 目的：通過研究谷氨酰胺酶(glutaminase，GLS)在大腸癌中的作用和表達調(diào)控機制，明確腫瘤細胞代謝異常的表觀遺傳基礎，尋找干預治療它的策略。
　　 方法：①用WesternBlot技術檢測大腸癌細胞中GLS蛋白表達情況；②應用GLS-siRNA敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測對細胞增殖的影響；③利用流式細胞儀檢測GLS蛋白敲除

6、后細胞凋亡情況及應用OAA/NAC后對凋亡的影響；④利用ATP檢測試劑盒分析抑制GLS蛋白后細胞能量改變；⑤通過real-timePCR檢測腸癌組織和細胞中miR-137表達情況；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測對細胞增殖的影響；⑦應用一個誘導APC蛋白表達引起內(nèi)源性miR-137表達增強的細胞模型分析miR-137和GLS蛋白的靶標關系；⑧構建野生型和突變型pMIR-GILS-3'-UTR熒光

7、報告載體直接證明miR-137和GLS蛋白的相互作用。
　　 結果：①WesternBlot結果說明大腸癌細胞系GLS蛋白表達上調(diào)；②應用GLS-siRNA敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測其對細胞增殖有明顯抑制作用；③流式細胞儀檢測GLS蛋白敲除后細胞凋亡增多，應用OAA/NAC后凋亡有所減少；④ATP檢測發(fā)現(xiàn)抑制GLS蛋白后細胞能量產(chǎn)生反而有所增多；⑤real-timePCR檢測腸癌組織和細胞中miR-137表達

8、下調(diào)；⑥用miR-137mimic敲除腸癌細胞系GLS蛋白表達后用MTS方法檢測其對細胞增殖有抑制效果；⑦誘導APC蛋白表達后real-timePCR檢測細胞內(nèi)源性miR-137表達增強，WesternBlot檢測細胞GLS蛋白表達下降，應用miR-137inhibitor后發(fā)現(xiàn)GLS蛋白表達有所恢復，且MTS檢測細胞增殖抑制也消失；⑧pMIR-GLS-3’-UTR熒光報告載體證明miR-137和GLS蛋白存在直接相互作用。